生防链霉菌PBSH9对马铃薯疮痂病菌的抑制作用及其代谢物培养条件优化

王丽玮 万中义 宋亚迪 修志君 于世成 杜美娥 张笑宇*

（1 内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010019；2 湖北省生物农药工程研究中心，湖北武汉 430070；3 鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯 017010）

马铃薯（L.）是一种重要的全球性作物，在国内外大面积种植，其种植面积仅次于水稻、小麦和玉米，在经济发展中发挥着重要的作用。2018 年全球马铃薯产量约为3.68 亿t，我国马铃薯总产量达9 000 万t，成为马铃薯产量第一大国（Liu et al.，2020；Li et al.，2021）。

马铃薯疮痂病（potato common scab）是由多种植物病原链霉菌（spp.）引起的世界范围内重要的土传病害，被称为马铃薯第四大病害，发生日趋严重（Chi et al.，2021），给全世界各马铃薯产区带来了严重威胁（Dees &Wanner，2012）。马铃薯感染疮痂病菌后，在块茎表面形成木栓状隆起、凹陷或平状病斑（Kinga &Calhoun，2005），对马铃薯的品质造成影响，降低其经济价值。在美国，疮痂病是马铃薯五大病害之一（Wanner，2009）。加拿大82%的马铃薯生产区都会发生马铃薯疮痂病，每年因该病害造成的经济损失在1 530 万～1 730 万美元之间（Hill &Lazarovits，2005）。我国多个省份报道有该病的发生（杜魏甫，2016），在内蒙古自治区，马铃薯疮痂病的发生尤为严重，商品田发生面积达16.6 万hm，种薯田发生面积为0.07 万hm（张建平 等，2018），一些马铃薯微型薯种植区的发病率已高达90%（梁宏杰 等，2021）。寻找一种绿色高效的疮痂病防治方法，成为了马铃薯产业亟待解决的问题。

使用抗病品种是马铃薯疮痂病最经济有效的防治措施，但是抗疮痂病的马铃薯品种较少，且未发现对疮痂病菌具有完全抗性的品种（Dees &Wanner，2012）。有的采用轮作和降低土壤pH 值的方法，但效果不理想（陈利达 等，2020）；化学防治在一定程度上可减轻该病害的发生，但不能达到彻底防治的目的，使用不当还会产生副作用（李爽 等，2018；Yang et al.，2021）；生物防治不会造成环境污染和毒素残留，可连续持久地控制该病害（Alamri et al.，2012）。近年来的研究结果表明，生防菌芽孢杆菌（spp.）对马铃薯疮痂病有明显的防治效果，包括侧孢芽孢杆菌（）（Chen et al.，2017）、解淀粉芽孢杆菌（）（Lin et al.，2018）和高地芽孢杆菌（）（Li et al.，2019）等。此外，一些非致病链霉菌也可有效地防治马铃薯疮痂病，如玫瑰黄链霉菌（）Menmyco-93-63 发酵液与蛭石混合后对马铃薯疮痂病的防效为49.02%（许华民，2015）；橄榄色链霉菌（）和褶皱链霉菌（）也被报道具有抗马铃薯疮痂病菌的活性（Zadeh et al.，2006）。

内蒙古农业大学植物病理学课题组前期从马铃薯疮痂病病斑上分离到1 株生防链霉菌PBSH9，经鉴定为链霉菌的1 个新种（Zhang et al.，2020），命名为sp.nov.（登录号：JAKZEO000000000）。本试验研究该生防菌及其代谢物对马铃薯疮痂病菌形态的影响，并用单因素试验优化PBSH9 的发酵条件，为该生防菌的研发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

生防链霉菌PBSH9（sp.nov），马铃薯疮痂病菌加利利链霉菌PS1（），均由内蒙古农业大学植物病理实验室分离保存。

1.2 培养基

高氏1 号培养基：MgSO·7HO 0.5 g、FeSO·7HO 0.01 g、KNO1 g、NaCl 0.5 g、KHPO0.5 g、淀粉20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃下灭菌30 min。

ISP培养基：葡萄糖4 g、酵母浸粉4 g、麦芽浸粉10 g、琼脂16 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃下灭菌30 min。

1.3 试验方法

1.3.1 生防链霉菌PBSH9 对马铃薯疮痂病菌PS1的抑制作用 2021 年6月利用平板对峙法评价菌株PBSH9 对病原菌PS1 的抑制作用。将PS1 置于液体ISP培养基中28 ℃振荡培养2 d，使其菌悬液浓度为1 × 10cfu·mL，再取200 μL 菌悬液均匀涂在ISP固体培养基上，用直径为5 mm 的无菌打孔器取菌株PBSH9 菌饼，倒置于涂有PS1 的ISP固体培养基平板中央，以没有菌的固体培养基作对照，设置5 个重复，28 ℃培养3 d，观察抑菌效果。将菌株PBSH9连续培养3 代，用相同的方法观察PBSH9 对PS1 抑制效果的稳定性，十字交叉法测量抑菌圈直径，计算抑制率，并在光学显微镜下观察PS1 的菌丝和分生孢子形态变化。

1.3.2 生防链霉菌PBSH9 代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制作用 将菌株PBSH9 接种在固体高氏1 号培养基上，28 ℃下培养3 d，取2 个直径为5 mm 的菌饼，置于80 mL 液体高氏1 号培养基中，180 r·min、28 ℃恒温下振荡培养。从0 h 开始每隔12 h 取样测定菌液在波长为600 nm 处的吸光值（OD），绘制生长曲线，确定PBSH9 对数生长期，并以此时期的菌悬液作为后续培养试验的种子液。每组试验3 次重复。

每100 mL 液体高氏1 号培养基中接入5 mL OD在1.189 左右的PBSH9种子液，28 ℃振荡培养5 d，10 000 r·min离心10 min，取上清液，再用孔径为0.22 μm 的过滤器将其过滤，得到PBSH9 代谢物，置于灭菌的离心管中，4 ℃保存 备用。

以打孔法检测代谢物的抑菌活性。向直径为90 mm 的培养皿中倒入20 mL 固体ISP培养基，待培养基凝固后取200 μL 病原菌PS1（1 × 10cfu·mL）菌液均匀地涂在培养基表面，用灭菌的打孔器在距离平板中央2 cm 处分别打3 个直径为5 mm的孔，向孔中分别注入菌株PBSH9 的代谢物、125 μg·mL氯霉素（阳性对照，CK1）、液体高氏1号培养基（空白对照，CK2）各100 μL。3 次重复。28 ℃恒温培养2 d，十字交叉法测量抑菌圈直径，计算抑制率。同时在光学显微镜下观察PS1 的菌丝和分生孢子形态。

1.3.3 生防链霉菌PBSH9 培养条件的优化 ①培养时间及接种量对PBSH9 抑菌活性的影响。在100 mL 液体高氏1 号培养基中，分别接入OD约为1.189 的PBSH9 种子液3、5、7、9 mL，180 r·min、28 ℃条件下振荡培养1～12 d，每隔24 h 取1 次样，10 000 r·min条件下离心10 min 后用孔径为0.22 μm 的过滤器过滤得到代谢物，置于灭菌的离心管中，4 ℃保存备用。按照1.3.2 的方法在涂有病原菌PS1 的固体高氏1 号培养基上打孔，每个孔中接入100 μL 代谢物，28 ℃恒温培养3 d。以抑菌圈直径判断最优培养时间及接种量。每组试验3 次重复。

② 培养温度对PBSH9 抑菌活性的影响。在100 mL 液体高氏1 号培养基中接入7 mL PBSH9 种子液，转速为180 r·min，设置温度梯度为22、25、28、31 ℃和34 ℃，分别振荡培养9 d，按照①中的方法获得代谢物并用打孔法判断最优培养温度。每个处理3 次重复。

③培养基pH 对PBSH9 抑菌活性的影响。调节液体高氏1 号培养基的pH 为4～12，每个pH 梯度分别接入7 mL PBSH9 种子液，180 r·min、28 ℃条件下振荡培养9 d，按照①中的方法获得代谢物并用打孔法判断最优培养pH。每个处理3次重复。

1.4 数据分析

试验结果利用Excel 2010 软件进行统计分析，统计结果利用SPSS 20.0.0分析软件进行数据分析，并检验处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 生防链霉菌PBSH9 对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制作用

PBSH9 对病原菌PS1 具有显著的抑制作用，培养3 代的抑制率均大于70%，一代、二代、三代的抑制率分别为74.79%、74.13%、75.00%，抑制效果稳定，三者间无显著差异。由图1 可知，PBSH9 对PS1 菌丝有明显的致畸作用，气生菌丝与基内菌丝都会出现生长畸形的情况，菌丝发生交联，基内菌丝交联尤其严重（图1-E、1-F）；气生菌丝变短、由弯变直、明显膨胀变粗，且菌丝出现断裂，原生质渗漏（图1-E）。此外，PBSH9 会使PS1 的孢子变形，产孢数量降低。共培养24 h 时，与对照（图1-G）相比，孢子变小且数量明显减少（图1-H）。

图1 生防链霉菌PBSH9 对马铃薯疮痂病菌PS1 的影响

2.2 生防链霉菌PBSH9 代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制作用

2.2.1 生防链霉菌PBSH9 的生长曲线 如图2 所示，PBSH9 在液体高氏1 号培养基中培养，培养0～24 h 为菌株缓慢增长期；培养36～72 h 菌株生长速度最快，为对数生长期；72 h 后菌液OD值趋于稳定，菌株生长处于稳定期。

图2 生防链霉菌PBSH9 的生长曲线

2.2.2 生防链霉菌PBSH9 代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制作用 由图3 可见，PBSH9 代谢物对病原菌PS1 有较强的抑制作用，平均抑菌圈直径20.17 mm，抑制率为75.21%，显著高于阳性对照氯霉素对PS1 的抑制率59.45%（平均抑菌圈直径12.33 mm）。由图4 可知，经PBSH9 代谢物处理后，PS1 的菌丝畸形，膨胀变粗、变短，出现严重的交联、断裂，产孢量降低，孢子由圆形变为水滴状。经氯霉素处理的PS1 菌丝也会畸形，与PBSH9 代谢物处理相比菌丝会更粗，有少数菌丝会断裂，孢子变为梭形，中间粗，两端较细。此外，PBSH9抑制了PS1 的菌丝生长，在透明抑菌圈内可以观察到少量的PS1 孢子，将抑菌圈内的孢子转移到新的ISP培养基中培养2 d，发现有菌落长出，说明抑菌圈内的孢子仍有活性（图5）。

图3 生防链霉菌PBSH9 代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制作用

图4 生防链霉菌PBSH9 代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 的影响

图5 生防链霉菌PBSH9 代谢物对抑菌圈内马铃薯疮痂病菌PS1 孢子的影响

2.3 生防链霉菌PBSH9 培养条件的优化

2.3.1 培养时间及接种量对生防链霉菌PBSH9 代谢物抑菌活性的影响 不同培养时间及接种量都会对PBSH9 代谢物的抑菌效果产生影响（表1），当PBSH9 种子液接种量为3 mL 时，培养9 d 的代谢物的抑菌效果最好，抑菌圈直径为22.67 mm；接种量为5 mL 时，培养3 d 和4 d 的抑菌圈不清晰，但较大（图6），培养5 d 时，抑菌圈内无菌丝生长，对病原菌的抑制效果最好，抑菌圈直径为19.83 mm；接种量为7 mL、培养9 d 和10 d 时代谢物的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为24.00 mm 和23.17 mm；接种量为9 mL、培养6 d 和7 d 时抑菌圈直径分别为20.50 mm 和19.83 mm。综合比较，每100 mL 液体高氏1 号培养基中接入7 mL 种子液，培养9 d 时代谢物的抑菌效果最好。

图6 接种量为5 mL 培养3 d（左）和4 d（右）时生防链霉菌PBSH9 的抑菌活性

表1 培养时间及接种量对生防链霉菌PBSH9 代谢物抑菌圈直径的影响 mm

2.3.2 培养温度对生防链霉菌PBSH9 抑菌活性的影响 当培养温度为28 ℃时PBSH9 代谢物的抑菌效果最好，抑菌圈直径最大，为23.67 mm。温度升高或降低，其抑菌活性都有所下降（图7）。

图7 培养温度对生防链霉菌PBSH9 抑菌活性的影响

2.3.3 培养基pH 对生防链霉菌PBSH9 抑菌活性的影响 由图8 可知，PBSH9 在培养基pH 为4～12的范围内都可生长，当pH 为7 时，PBSH9 代谢物的抑菌效果最好，抑菌圈直径最大，为23.67 mm。酸性和碱性培养条件下抑菌活性都有所下降。

图8 培养基pH 对生防链霉菌PBSH9 抑菌活性的影响

3 讨论

疮痂病在世界范围内给马铃薯生产造成了严重的经济损失，在众多的防治措施中，生物防治备受学者关注。非致病链霉菌属于土壤习居菌，能在致病链霉菌存在的地方生存，因此作为生防菌具有一定的优势（杨冰 等，2021）。Kobayashi 等（2012）从野生燕麦栽培地分离出的链霉菌sp.WoRs-501 对马铃薯疮痂病菌有较强的抑制作用，与干土混合后可使病害严重程度降低78%～94%。刘萍萍（2016）发现链霉菌sp.CC5 可以抑制马铃薯疮痂病菌的生长，抑菌圈大小为10.5 mm，经紫外诱变后，该链霉菌的抑菌作用提高了25%，且经过传代培养10 代后，抑菌作用没有减弱。本试验中生防链霉菌PBSH9 也可抑制马铃薯疮痂病菌的生长，传代培养3 代，对马铃薯疮痂病菌PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果稳定。

生物防治的机制主要是利用微生物种内或种间的竞争、溶菌、抗生、重寄生等作用，也有一些是通过合成次级代谢产物来诱导植物产生抗病性，同时促进植物生长。抗菌活性物质通常是拮抗放线菌发挥生物学作用的基础，而链霉菌具有较高的天然产物生物合成能力，因生产抗生素而闻名（Chater，2006；Nett et al.，2009）。Sarwar 等（2018）发现链霉菌A1RT 的甲醇提取物对马铃薯疮痂病菌表现出较高的抑菌活性，抑菌圈直径为26 mm。同时该团队还从紫黑链霉菌AC12AB 中发现了阿扎霉素RS-22A，使马铃薯疮痂病的发病率降低83%，马铃薯产量增加26.8%（Sarwar et al.，2019）。Eckwall 和Schottel（1997）从strain PonSSII 中发现了1个只对马铃薯疮痂病菌有抑制作用的分子量在500 左右的化合物。本试验中，生防链霉菌PBSH9 的代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 也具有明显的抑制作用，平均抑菌圈直径为20.17 mm，今后有必要对该菌活性物质进行进一步研究。

莽春霞（2016）在研究灰色链霉菌（）对烟草靶斑病菌（Kühn）的抑制作用时发现，烟草靶斑病菌被抑制后，菌丝会出现节间变短、变粗、扭曲变形、菌丝分隔增多等现象。本试验中，利用生防链霉菌PBSH9 及其代谢物抑制马铃薯疮痂病菌PS1 时，被抑制的病原菌菌丝也会出现交联、变粗和断裂等畸形现象。

抑菌活性物质的产率决定抑菌效果，发酵是获得大量微生物活性代谢产物的基础（Duan et al.，2020）。邸垫平等（2006）从玫瑰黄链霉菌Menmyco-93-63 的代谢产物中分离具有抑制马铃薯疮痂病菌的化合物时，发酵7 d 就进行萃取分离。戴蓬博等（2016）利用极长链霉菌（）SL01 代谢产物防治苹果树腐烂病（Miyabe et Yamada）时，50 mL 液体培养基中只接入1 mL 培养3 d 的种子液，发酵培养7 d 后的代谢物就可对苹果树腐烂病菌有较强的抑制效果。项仁鑫等（2018）在30 mL 培养基中接入1.5 mL生长32 h 的种子液，发酵7 d，链霉菌HY6-S36 的星孢菌素产量最高。不同接种量对代谢物抑菌活性的影响较大，主要是因为接种量较小时，会影响菌株的生长繁殖速度，而接种量过大，会引起摇瓶内溶氧不足，间接影响菌株生长，这两种情况都会导致菌株次级代谢产物含量降低，最终影响代谢物的抑菌效果（周跃慧，2018）。基于此原因，本试验中不同接种量的代谢物对马铃薯疮痂病菌表现出了不同程度的抑制作用。此外，菌株PBSH9 在培养72 h 后处于生长稳定期，但接入7 mL 种子液、培养9 d 时代谢物的抑菌效果最好。虽然从生产角度来说培养9 d 浪费大量资源，生产成本显著增加，但3 d 与9 d 的代谢物抑菌效果差异显著，因此确定培养周期为9 d。不同研究得出的结论不尽相同，可能和不同菌株有关，也可能与培养条件等多种因素有关，还需进一步研究，为该菌株的应用奠定基础。

4 结论

生防链霉菌PBSH9 及其代谢物对马铃薯疮痂病菌PS1 有明显的抑制作用，菌株传代培养3 代对PS1 的抑制率均大于70%，抑制效果稳定；PBSH9代谢物的平均抑制率为75.21%。该生防菌及其代谢物使病原菌菌丝发生交联，变短，变粗，孢子变形，产孢量明显减少，但透明抑菌圈内的少量孢子仍有活性。每100 mL 液体高氏1 号培养基中接入7 mL OD在1.189 左右的生防菌PBSH9 种子液，调节培养基的pH 为7，转速为180 r·min、28 ℃下恒温培养9 d 得到的代谢物抑菌效果最好，抑菌圈直径为23.67 mm。