生防菌+恶霉灵最优组合的筛选及对苦瓜枯萎病的防治效果研究

王炎峰 田叶韩 魏滟洁 高克祥

（山东农业大学植物保护学院，山东省蔬菜病虫生物学重点实验室，山东泰安 271000）

苦瓜枯萎病是由尖孢镰孢菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）引起的一种重要的土传病害（Sun & Huang，1982）。该专化型的部分菌株除侵染苦瓜外，还可以侵染葫芦。此病原菌在苦瓜整个生长周期均可侵染，在盛果期发病最为严重。在苦瓜的主要种植区，由于高温高湿的生长环境以及多年连作等原因，苦瓜枯萎病时常发生，造成严重的经济损失（陈振东 等，2016）。苦瓜植株受到病原菌侵染后下部叶片的叶脉呈网状黄化，上部叶片逐渐变黄，最后茎叶坏死，植株逐渐萎缩死亡，切开病株可发现其维管束变成褐色（陈振东 等，2014）。目前生产上对该病害的防治以农业栽培和化学农药防治为主，但化学防治存在农药残留、抗药性等问题（肖荣凤 等，2015）。山东省蔬菜病虫生物学重点实验室调查发现市场上销售的对西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防效的微生物制剂对苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想，因此，寻求一种安全有效的防治措施十分 必要。

绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）是一种极具生防潜力的重要生防菌，现已有大量关于绿针假单胞菌生物防治的研究报道，该菌对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好的防治效果（申顺善 等，2016）；何延静等（2006）发现绿针假单胞菌对辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）具有强拮抗作用。李惠（2009）研究发现绿针假单胞菌能够诱发菜豆对灰霉病菌的抗性且能够促进菜豆生长，并对杨树腐烂病菌（Valsa sordida）、板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）等多种病菌都有较强的抑制作用。张清霞等（2018）研究发现绿针假单胞菌主要通过产生抗生素防治水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）；该菌对黄瓜枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）、苦瓜枯萎病菌 （F. oxysporum f. sp. momordicae）均有较好的生防效果（侯圆圆，2017）。

恶霉灵不仅是内吸性杀菌剂，同时也是土壤消毒剂，对腐霉菌、镰刀菌等引起的猝倒病有较好的预防效果（尹凯，2018）。恶霉灵对土壤中病原菌以外的细菌、放线菌的影响很小，故而对土壤中的微生物生态影响很小。

本实验室前期研究发现绿针假单胞菌G5 对苦瓜枯萎病菌有较好的抑制作用，并对盆栽苦瓜枯萎病防治效果最优的生防菌+农药组合进行了初步筛选（侯圆圆，2017），发现绿针假单胞菌G5+恶霉灵组合对盆栽苦瓜枯萎病的防治效果最优，但未进行不同浓度生防菌G5 与恶霉灵药剂复配的筛选，因此，本试验进一步优化生防菌+农药组合配方，以求筛选出对苦瓜枯萎病防治效果更好的菌药组合，并在田间条件下验证其防效，为有效防治苦瓜枯萎病提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试苦瓜品种为如玉41 号，由福建农科农业良种开发有限公司生产；绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）G5 菌株，由本实验室保存；苦瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. momordicae）SG-15 菌株，由本实验室分离并保存；99%恶霉灵（hymexazol，简称Hym）原药由潍坊华诺生物科技有限公司生产、山东天达生物股份有限公司监制，按照推荐使用浓度稀释4 000 倍使用；培养基：LB 培养基、 LA 培养基、PDB 培养基、PDA 培养基；盆栽用土：选择10 a 以上无耕作的树林土，与基质按照2∶1 的体积比混匀，所用基质购自山东风景园林有限公司；防御酶测定试剂盒：过氧化物酶（A084-3）、苯丙氨酸解氨酶（A137）、多酚氧化酶（A136）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。

试验于2017 年4～9 月进行。生防菌+农药最适组合的筛选于山东农业大学北校区温室完成；防御酶活性测定于山东省蔬菜病虫生物学重点实验室完成；生防菌+农药最优组合的田间防效试验于山东农业大学南校区完成。

1.2 试验方法

1.2.1 绿针假单胞菌G5 菌悬液和苦瓜枯萎病菌孢子悬浮液的制备 绿针假单胞菌G5 在LA 固体培养基上28 ℃培养24 h 至长出单菌落，挑取单菌落再次纯化，挑取纯化出的单菌落加入到含有40 μg · mL-1利福平（Rif）的LB 培养基中于28 ℃恒温振荡培养17 h，10 000 r · min-1离心10 min 去除培养液，将细菌沉淀用自来水重悬。用比浊法将G5 菌 悬 液 调 节 成1×108、1×109cfu · mL-12 个 浓度。

苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株孢子悬浮液的制备：配制PDB 培养液，250 mL 的锥形瓶中装液量为150 mL，高压湿热灭菌，冷却后每瓶中接入3 块直径为6 mm 的苦瓜枯萎病菌菌饼，26 ℃恒温160 r · min-1振荡培养7 d，用灭菌过的滤网过滤菌丝，得到孢子悬浮液，用血球计数板计数，确定孢子悬浮液浓度。

1.2.2 G5+恶霉灵对盆栽苦瓜幼苗的促生效果 2017 年4 月选用颗粒饱满的苦瓜种子，用无菌水洗3～5 次，放入50～60 ℃无菌水中浸泡，水没过种子，用无菌的封口膜覆盖瓶口，转移到28 ℃恒温摇床中160 r · min-1振荡6～8 h。用无菌水把灭菌的纱布润湿，平铺在培养皿中上下各4 层，中间放置浸泡过的苦瓜种子，置于32 ℃恒温培养箱中催芽48 h 左右。种子露白后播于50 穴的育苗盘中，放置在光照培养箱中培养，设置光照时间14 h、温度26 ℃，黑暗时间10 h、温度22 ℃。幼苗长到两叶一心时移栽。

取制备好的盆栽用土装入高10 cm、内口径宽12 cm 的花盆中，每盆200 g，共设置12 个处理，每处理9 盆，每盆移栽1 株苦瓜，3 次重复。恶霉灵推荐使用浓度为250.0 mg · L-1，本试验用1×108、1×109cfu · mL-12 个浓度的G5 菌悬液将恶霉灵稀释至250.0、187.5、125.0、62.5 mg · L-14 个浓度（分别为推荐使用浓度的100%、75%、50%、25%），移栽时每盆相应浇灌10 mL G5 菌悬液、恶霉灵及二者组合至苦瓜根部，具体盆栽试验设计见表1。

苦瓜移栽后15 d 对苦瓜株高、茎粗、叶面积及全株鲜质量、干质量进行测定。株高、茎粗的测定参照李雪玲（2018）的方法。叶面积测定参照柏军华等（2005）的方法。用清水冲洗根部土壤，吸干苦瓜体表水分，在电子天平上测定鲜质量。接着将苦瓜植株放入烘干箱，105 ℃杀青处理30 min，85 ℃下烘干至重量不再变化，测定干质量。

表1 盆栽试验设计

1.2.3 G5+恶霉灵对盆栽苦瓜枯萎病的防治效果 取制备好的盆栽用土装入高10 cm、内口径宽12 cm 的花盆中，每盆200 g，向每盆加入制备好的苦瓜枯萎病菌孢子悬浮液，使每克土壤中病菌孢子为1×106个，在自然状态下风干，将风干带菌土壤混匀后立即移栽苦瓜。每处理设置3 次重复，每重复15 盆，每盆1 株苦瓜。除将1.2.2 中的健康土换成含有苦瓜枯萎病菌的病土外，其他操作均与1.2.2相同，此时将清水处理记为CK。

在苦瓜移栽15 d后以重复为单位调查统计苦瓜枯萎病的发病率、病情指数，并计算防治效果。苦瓜枯萎病苗期病害分级标准（陈振东 等，2014）：0 级，植株健康，无病症；1 级，子叶发黄；3 级，子叶变黄，边缘皱缩，但真叶正常；5 级，子叶有皱缩枯死现象，部分真叶开始发黄；7 级，真叶发黄，部分叶片黄化或停止生长；9 级，全株萎蔫或 枯死。

1.2.4 G5+恶霉灵对盆栽苦瓜幼苗叶片防御酶活性的影响 试验共设置CK0、CK、B、Hym、B+0.75Hym 5 个处理，处理方法同1.2.3。取移栽 前、移栽后3、6、9、12、15 d 6 个时期生长情况一致的苦瓜植株底部叶片，每处理随机选取3 株，用液氮运输并充分研磨均匀，采用防御酶测定试剂盒对苦瓜防御酶进行测定。

1.2.5 苦瓜枯萎病高发病样地模型制备 本试验以山东农业大学植保试验站（北纬 36°18′，东经 117°17′）为定位试验平台。人为引入苦瓜枯萎病菌，将制备好的苦瓜枯萎病菌孢子悬浮液用自来水稀释100 倍后按1∶1 的质量比与草炭土混匀，继续进行二次扩繁，30 d 后将扩繁好的含病原菌草炭均匀撒入试验田中（1 kg · m-2），旋耕整地，将健康土壤转化为枯萎病高发病土壤，试验区域土壤中病原菌的含量为1×103～1×104cfu · g-1（干土）。以此为模型，验证盆栽试验筛选出的生防菌G5+恶霉灵最优组合对苦瓜枯萎病的田间防治效果。

1.2.6 G5+恶霉灵对苦瓜枯萎病的田间防治效果 试验由随机挑选的4 个区域构成，每个试验区域长12 m、宽1.2 m，种植2 行苦瓜，前后株间距0.6 m，左右株间距1.0 m。每一区域对应一组处理，每个处理种植30 株苦瓜。共设置CK、B、Hym、B+0.75Hym 4 个处理，苦瓜移栽前打好定植穴，每个定植穴中浇灌100 mL 4 个处理的菌、药、菌药最优组合，移栽后30 d 再次浇灌100 mL 上述菌、药或菌药最优组合。分别于移栽后30、60 d 调查苦瓜枯萎病的发病情况，病情指数与防治效果的计算方法同1.2.3。试验期间测定小区苦瓜总产量。

苦瓜枯萎病田间发病严重度分级标准（李雪玲，2018）：0 级，无病症；1 级，轻微发病，30%以下的叶片出现叶脉黄化现象；3 级，中度发病，30%～70%的叶片出现叶脉黄化现象；5 级，高度发病，全株叶片叶脉黄化，未明显影响植株的生长发育；7 级，全株叶片叶脉黄化且呈现萎蔫症状，维管束变褐，植株停止生长发育；9 级，植株 死亡。

1.3 数据分析

利用 SPSS 20.0 和 Excel 2007 软件对数据进行方差分析、显著检验并作图。

2 结果与分析

2.1 G5+恶霉灵不同组合对盆栽苦瓜幼苗的促生效果

苦瓜盆栽试验结果表明：施用绿针假单胞菌G5、恶霉灵及二者组合处理能够明显提高苦瓜茎粗、株高、叶面积、干质量、鲜质量，表现出不同的促生效果。总体来看，B+0.75Hym 处理（1×109cfu · mL-1G5 菌 悬 液+187.5 mg · L-1恶霉灵）各项生理指标均较高，促生效果最为明显 （表2）。

2.2 G5+恶霉灵不同组合对盆栽苦瓜枯萎病的防治效果

试 验 结 果 显 示（表3），与1×108cfu · mL-1G5 菌悬液相比，1×109cfu · mL-1G5 菌悬液与恶霉灵各浓度复配对苦瓜枯萎病的防治效果较高；其中B+0.75Hym 处理对苦瓜枯萎病的防治效果为81.60%，明显高于其他处理，单独使用1×108cfu · mL-1G5 菌悬液对苦瓜枯萎病的防治效果为26.34%，低于其他处理。G5+恶霉灵各组合对苦瓜枯萎病的防治效果都要高于单独使用生防菌G5 或恶霉灵。

2.3 G5+恶霉灵不同组合对盆栽苦瓜幼苗叶片防御酶活性的影响

2.3.1 G5+恶霉灵不同组合处理下苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性变化 在整个取样周期中，PAL 活性呈现出先迅速升高后下降的趋势，CK0、CK、Hym 处理的苦瓜叶片PAL 活性在移栽后3 d 达到峰值；B+0.75Hym 处理的苦瓜叶片PAL 活性持续升高时间较长，在移栽后6 d 出现峰值。在整个取样周期内CK、Hym、B+0.75Hym 处理的苦瓜叶片PAL 活性总体高于CK0。Hym 处理的苦瓜叶片PAL 活性在移栽后3～12 d 变化较为平稳，但在12～15 d 剧烈下降。15 d 时PAL 活性表现为B+0.75Hym ＞B ＞CK ＞CK0 ＞Hym（图1-A）。

2.3.2 G5+恶霉灵不同组合处理下过氧化物酶（POD）的活性变化 CK0、CK 处理的苦瓜幼苗叶片POD 活性呈持续平稳上升趋势，移栽后9 d Hym 处理的POD 活性达到峰值后持续下降，活性下降幅度最大；12 d 时B 处理的POD 活性达到最大值；移栽后12～15 d 处理CK0、CK、B、Hym的 POD 活性均呈现下降趋势，而B+0.75Hym POD活性在15 d达到峰值，显著高于其他处理（图1-B）。

表2 G5+恶霉灵不同组合对盆栽苦瓜幼苗的促生效果

表3 G5+恶霉灵不同组合对盆栽苦瓜枯萎病的 防治效果

2.3.3 G5+恶霉灵不同组合处理下多酚氧化酶（PPO）的活性变化 不同处理的PPO 活性总体呈现上升趋势。移栽后3～6 d 出现小幅下降，随后又持续上升。移栽后9 d B+0.75Hym 处理的PPO活性高于其他处理，12～15 d B 处理的PPO 活性持续上升，在15 d 时达到峰值，此时PPO 活性大小依次为B ＞Hym ＞B+0.75Hym ＞CK0 ＞CK（图1-C）。

2.4 盆栽试验筛选出的菌药最优组合对苦瓜枯萎病的田间防治效果

从表4 可以看出，苦瓜幼苗移栽后30 d，对枯萎病的防治效果为B+0.75Hym（52.59%）＞Hym（49.35%）＞B（45.46%）；苦瓜幼苗移栽后60 d 时，防治效果为B+0.75Hym（32.13%）＞B （28.51%）＞Hym（24.09%）；苦瓜产量的高低与移栽后60 d 的防治效果相对应。

图1 G5+恶霉灵对盆栽苦瓜幼苗叶片防御酶活性的影响

3 结论与讨论

绿针假单胞菌G5 是分离自芫荽（香菜）茎内的一株内生菌，研究发现菌株G5 可产生多种次生代谢物质，如吩啧衍生物、氢氰酸（HCN）、嗜铁素和蛋白酶、植物生长素（IAA）等（李惠，2009）。侯圆圆（2017）通过平板对峙试验，发现绿针假单胞菌G5 菌株对苦瓜枯萎病菌SG-15 菌株的菌丝具有明显拮抗作用，采用不同接种方法，G5 菌株对SG-15 菌株菌丝生长的抑制率达到60%以上；试验还发现恶霉灵能够抑制苦瓜枯萎病菌的菌丝生长，故而能够减轻苦瓜枯萎病的发生。本试验将生防菌G5 与杀菌剂恶霉灵结合起来协同防治苦瓜枯萎病。试验结果表明，供试的8 种G5+恶霉灵组合防治盆栽苦瓜枯萎病的效果都要高于单独使用生防菌或农药，其中B+0.75Hym 处理（1×109cfu · mL-1G5+187.5 mg · L-1恶霉灵）的防治效果最好（表3），与此相似，曹小蕾等（2016）研究发现将杀菌剂、植物诱抗剂和生防微生物共同施用时能够更有效地抑制棉花黄萎病的发生。但张志红等（2011）研究发现生物肥与恶霉灵配施加重了香蕉枯萎病的发生，与本试验结果不一致，这可能是因为本试验中配施的恶霉灵浓度较低，且恶霉灵对生防细菌的影响较小造成的。

逆境胁迫破坏植株正常的生长和发育（杨书运 等，2007），影响植物生理活动、动态平衡（Wahid et al.，2007；邓茳明 等，2010），受逆境胁迫后植株组织内防御酶活性升高，以增强植物抗性 （Ashraf ＆ Foolad，2007）。台莲梅等（2008）研究发现不同大豆品种用尖孢镰孢菌毒素处理后根内PAL、PPO、POD 活性都要高于对照组，与其相似，本试验发现带菌土壤（CK）苦瓜叶片内的PAL、POD、PPO 活性总体高于健康土（CK0）（图1）。连清贵等（2016）研究发现番茄植株长势健壮时相关防御酶活性较高，灰霉病发生程度降低，与此相似，本试验发现对盆栽苦瓜促生效果最为明显的B+0.75Hym 处理对苦瓜枯萎病的防治效果最佳（表2、3、4），同时在整个取样周期内PAL、POD、PPO 3种防御酶的活性总体上表现较高。由此可见，植株的生长指标与病害的发生情况及相关的防御酶系统之间存在着密切的联系。

盆栽试验中筛选出的最优菌药组合B+0.75Hym 在防治苦瓜枯萎病田间试验中得到了有效的肯定，田间条件下，苦瓜苗移栽后30、60 d B+0.75Hym 处理对苦瓜枯萎病的防治效果高于单一施用B 或Hym；同时B+0.75Hym 处理的增产效果也最为明显。本试验仅将生防菌G5 与恶霉灵混合后加入到定植穴中，对于田间防效试验中的生防菌+农药的施用方式、施用时间仍需进一步的研究。