SSR标记技术在马铃薯遗传育种研究中的应用

李建武

（甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃兰州 730070）

简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）又称微卫星DNA（Microsatellite DNA），广泛分布在真核生物基因组的不同位置，且分布较为均匀，由于其重复次数不同或重复程度不完全而形成每个座位的多态性。SSR一般是由几个（多为1～6个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，在100 bp以内。SSR标记技术作为第2代基于PCR的一种新型DNA分子标记，其原理是根据SSR两端的特定顺序序列设计互补的寡聚核苷酸引物，对SSR进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性，表现为共显性。

SSR标记具有多态性高、重复性好、数量丰富、分布于整个基因组、特异性扩增、发生频率高、共显性遗传、对DNA数量和质量要求不高、批量操作等优点。自该技术于1991年创立以来，被广泛应用于植物遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助选择育种和遗传多样性研究等方面（Bonierbale et al.，1988），同样在马铃薯构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选等研究方面也得到广泛应用（Collins et al.，1999；Ghislain et al.，2009）。

1 马铃薯SSR的发展

SSR引物的获取途径主要有三条：其一，直接应用已经公开发表的SSR引物，随着马铃薯基因组测序的不断深入和完善，公开发表的SSR标记日益丰富；其二，使用近缘物种的引物，如利用茄科番茄的保守序列作为引物的结合位点完成 PCR（Polymerase Chain Reaction）反应（Frary et al.，2005）；其三，开发SSR引物，通过核酸数据库GenBank、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、EMBL（European Molecular Biology Laboratory）筛选简单重复DNA序列，或从已建立的克隆文库中获得简单重复DNA序列的阳性克隆，然后根据其两侧保守的DNA序列设计特定的SSR引物。

1.1 马铃薯基因组SSR引物的开发

Veilleux等（1995）首次将 SSR标记技术应用在马铃薯花药培养再生二倍体植株的遗传分析上。马铃薯和番茄分子连锁遗传图谱的深入研究证明了马铃薯和番茄高度保守区域的相似性（Bonierbale et al.，1988；Tanksley et al.，1992），随着番茄SSR引物的不断开发，也相应地增加了马铃薯SSR引物的数量，促进了SSR标记在马铃薯研究中的应用。马铃薯SSR的引物开发与筛选研究始于1996年，Provan等（1996）根据番茄和马铃薯的24个功能基因中的简单重复序列设计了22对SSR引物，其中19对引物具有多态性。Mibourne等（1998）利用EMBL、cDNA文库和富集小片段插入DNA文库中的马铃薯简单重复序列，共设计了112对SSR引物（STM001系列），对4个二倍体和2个四倍体马铃薯无性系进行了遗传分析，其中的98对SSR引物具有多态性。Ashkenazi等（2001）通过建立的二倍体马铃薯栽培种富利哈种（Solanum phurejaJuz.）和野生种恰柯种（S. chacoenseBitt.）的2个基因组文库，设计了30对新的SSR引物。

1.2 基于EST的SSR标记

SSR标记的传统开发涉及一系列繁复的操作过程，效率较低，成本较高，限制了SSR标记在许多马铃薯遗传分析中的应用，长期以来仅在模式植物或者经济价值较高的作物上得到开发和应用。随着表达序列标签（Expressed Sequence Tags，ESTs）的大量测定，快速增长的EST序列信息为 SSR标记的开发提供了丰富的资源。截止到 2011年初，NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的EST数据库收录了逾39万条马铃薯EST序列。Ghislain等（2004）根据EST序列设计了48对SSR引物，经过筛选最后得到了13个新的SSR标记（STM5000系列）。Feingold等（2005）通过美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research，TIGR）数据库的马铃薯基因组简单重复序列，设计了94对引物，经合成后扩增马铃薯DNA，成功开发了61个SSR标记（STI系列），这些SSR引物能够鉴别选自南美的30个马铃薯品种。马铃薯SSR标记的不断开发及引物序列的公开发表，极大地促进了SSR技术在马铃薯品种鉴定及遗传多样性等方面的研究。

2 SSR标记在马铃薯遗传育种方面的应用

2.1 品种鉴定与种质资源研究

SSR标记从DNA分子水平上对马铃薯品种进行鉴定，准确、高效、批量鉴别出不同的基因型，已成为一种有效的鉴定方法，结合SSR标记的多态性及其精确的片段大小，即可建立对应于每一品种的标准指纹图谱，将为品种在分子水平上提供独特的鉴定特征，以鉴别品种。Kawchuk等（1996）利用3对SSR引物在95个马铃薯栽培品种扩增出了851个多态性位点，区分了其中的73个品种。McGregor等（2000）利用SSR标记对39个南美当地马铃薯栽培品种进行了分析，5对SSR引物有效区分了其中的24个。Ashkenazi等（2001）利用4对公开的SSR引物和根据基因组文库开发的3对新的SSR引物共7对，可以鉴定区别12个不同的马铃薯栽培品种，且其中的2对SSR引物可完全鉴别出这些品种，多态性位点的等位基因数为3～6，平均等位基因数为5。Norero等（2002）利用SSR标记对来自德国等12个国家的37个马铃薯品种进行了分子鉴定，3对引物可将其中的36个品种区分开，由于Shepody和Achirana INTA两个品种出现了相似的特异性谱带，利用另外一对引物将其区分开，即4对SSR引物可将所有37个品种完全区分。Ghislain等（1999）利用70个SSR标记对来自国际马铃薯中心（CIP）的9个类型（且每个类型不少于4个基因型）的73个马铃薯种质材料进行了扩增，筛选了包含18个具有多态性的SSR标记，这些标记可在7大栽培种中均扩增出该多态性片段，可以有效地区分不同品种。Ghislain等（2004）利用156对SSR引物对来自CIP的8个类型的931个马铃薯种质材料进行了分析，筛选出的18对SSR引物可高效、准确地鉴定马铃薯种质资源。Ghislain等（2009）利用88个SSR标记对来自CIP保存4大类型的742份马铃薯种质资源（包含二倍体、三倍体、四倍体、五倍体）进行了分析，建立了含有 51个 SSR标记马铃薯遗传鉴定试剂盒，该试剂盒鉴定区别742份种质资源的有效性达到98.8%，而含有其中的24个SSR标记的试剂盒鉴定区别这些种质资源的有效性可达 93.5%，同时明确了标记等位基因片段大小，新的遗传鉴定试剂盒有助于马铃薯种质标准化选择和分析数据。Rosa等（2010）利用24个SSR标记对巴西的14个马铃薯主栽品种进行了分析，筛选出可以鉴定这些品种的2个SSR标记，且每一个多态性位点均为单形态带型。

我国在马铃薯品种鉴定、指纹图谱及遗传多样性方面的研究近几年发展较快，段艳凤等（2009）利用SSR标记构建了中国2000～2007年审定的88个马铃薯品种的指纹图谱并进行了遗传多样性分析，从138对SSR引物中筛选出6对引物构建了88个品种的SSR指纹图谱。王绍鹏等（2009）利用4对SSR引物对黑龙江省7个主栽品种进行遗传多样性分析，共获得144条多态性条带，其中3对引物完全可以区分7个马铃薯品种，剩余1对引物可以区分6个马铃薯品种，相似度分析表明，荷兰15与克新1号遗传距离较远，荷兰15与早大白、早大白与黄麻子间遗传距离较近。滕长才等（2009）利用30对SSR引物对青海省12份马铃薯主栽品种进行了遗传分析，扩增出359条多态性条带，12个品种的遗传距离介于0.238 5～0.480 1 cM之间，平均值为0.397 6 cM，品种遗传多样性水平较低。唐铭霞等（2010）从110对引物中筛选出16对SSR引物对四川省现有及引进的42份马铃薯材料进行遗传分析，共扩增出130个位点，其中多态性位点 116个，占总扩增位点的 89.2%，聚类分析表明，四川省栽培的马铃薯品种遗传多样性水平较低，品种间的遗传差异较小。

2.2 构建遗传连锁图谱与基因定位

遗传图谱（Genetic map）是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。高密度的遗传连锁图谱是遗传学家所追求的理想图谱，也是分子标记辅助选择育种的前提和基础。马铃薯二倍体野生种和四倍体栽培种遗传组成上高度杂合，自交退化现象严重，很难构建真正意义上的重组自交系，用于遗传图谱构建的群体多为 F1，其每粒实生种子都代表完全不同的基因型，通过无性繁殖的方式可以固定下来，相当于其他作物的 F2。自从美国康奈尔大学 Bonierbale 等（1988）利用二倍体S. phureja×（S. tuberosum×S. chacoense）杂交后代构建了第一个马铃薯RFLP图谱以后，国外许多学者以不同的二倍体马铃薯材料为作图群体，采用RFLP、AFLP、CAPS、SCAR、SSR等分子标记技术构建了多张马铃薯分子遗传图谱，极大地增加了马铃薯分子遗传图谱密度（Tanksley et al.，1992；Collins et al.，1999）。值得注意的是，荷兰瓦赫宁根大学van Os 等（2006）发表的以二倍体SH83-92-488×RH89-039-16杂交后代F1136个基因型为作图群体，利用AFLP、SSR、RFLP、CAPS、SCAR分子标记技术，构建的马铃薯“超密图谱”（UHD），包含12个连锁群，总共含有10 365个标记，平均每个厘摩（cM）就有10个以上标记，是目前世界上密度最大的马铃薯分子连锁图谱。Sørensen等（2008）利用包含 186个基因型的马铃薯双单倍体的BC1群体，借助AFLP和SSR标记对其亲本分别构建了含15个连锁群的分子遗传连锁图谱，获得分别含有158、137个标记的两套图谱，长度分别为882、1 099 cM，其中在Ⅰ染色体上分别含SSR标记为6、5个。

Luo等（2000）创建了根据同源四倍体亲本及全同胞子代表现型筛选的遗传标记预测四倍体个体基因型理论与统计方法，并以苏格兰作物研究所四倍体中间材料12601ab1与 Stirling亲本及其74个F1基因型为模拟作图群体，利用一组SSR标记数据模拟构建了一张四倍体马铃薯遗传图谱。Hackett和Luo（2003）开发出适用于同源四倍体物种构建连锁图谱的Tetraploid Map软件，为四倍体马铃薯分子连锁图谱的构建提供了理论支持和技术保障。根据同源四倍体的基因型理论、统计方法与Tetraploid Map软件，Bradshaw等（2008）以12601ab1×Stirling杂交后代F1227个基因型为作图群体，利用38对AFLP引物组合和6对SSR引物构建了两个亲本含有514个标记的12个连锁群的四倍体分子遗传连锁图，其中母本12601ab1遗传图谱上有293个SSR标记，父本 Stirling遗传图谱上有 221个 SSR标记，通过超高密度图谱的定位信息，利用 SSR标记STM3160和STM5140、STM3179和STM5148分别对Ⅳ、Ⅴ染色体进行精确鉴定，为准确构建遗传图谱提供了重要信息。

我国关于马铃薯分子遗传图谱的研究较少，金黎平等（2007）利用二倍体08675221×09901201杂交后代F1125个基因型通过AFLP标记技术构建了我国第一张马铃薯遗传连锁图谱，母本图谱含75个标记，12个连锁群长度为512 cM，父本图谱含95个标记，12个连锁群长度为578 cM。单友蛟等（2010）利用上述亲本F1167个基因型为作图群体，应用SSR标记构建了一张二倍体马铃薯分子遗传图谱，其总长度为645 cM的遗传连锁图谱，该图谱包含86个SSR标记，且较为均匀分布在各染色体上，每个染色体上的标记数为3～13个，距离为2～128 cM，标记间平均距离为7.5 cM。

较多的遗传图谱研究结合AFLP与SSR标记技术，相对于多态性较强的AFLP，SSR标记只扩增 1个位点，具有通用性，有利于比较以不同遗传背景构建的多张遗传图谱，这对于确定连锁群所属的染色体以及基因位点具有重要的意义。

基因定位是筛选与目标基因紧密连锁的遗传标记，它是基因图位克隆和分子辅助选择育种的前提。近年来，国外开展了许多马铃薯抗病虫和农艺性状及加工品质性状QTL定位的研究，如：抗晚疫病（Oberhagemann et al.，1999；Wickramasinghe et al.，2009）、抗虫（Caromel et al.，2003）、休眠期（Freyre et al.，1994a；Śliwka et al.，2008）、产量（Schäfer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、淀粉含量（Schäfer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、还原糖含量（Menendez et al.，2002；Li et al.，2005）、花青素含量（Zhang et al.，2009）及油炸颜色（D’hoop et al.，2008；Bradshaw et al.，2008）等。以二倍体马铃薯为材料，Freyre和Douches（1994b）将控制块茎比重的10个QTLs定位在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ等染色体上；Schafer-Pregl等（1998）将控制淀粉含量的18个QTLs定位在12个连锁群上，同时将控制产量的8个QTLs定位在8个连锁群上；Chen等（2001）将编码控制淀粉代谢酶的17个QTLs定位在12个连锁群上。以四倍体马铃薯为材料，Li等（2008）将解释 54.0%的淀粉含量表型变异的 10个 QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅺ等连锁群上，同时将解释26.1%淀粉产量表型变异的6个QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ等连锁群上，其中用SSR标记在Ⅺ染色体上与STM0037紧密连锁的等位基因对淀粉含量的贡献率为5.5%，对炸片色泽贡献率2.7%；Bradshaw等（2008）利用四倍体马铃薯亲本及其全同胞子代，对干物质含量、抗疮痂病等16个农艺性状和加工品质性状进行了定位分析，总共定位了39个QTL，其中在第Ⅴ染色体上定位了1个贡献率为56%的熟性QTL，同时在Ⅴ染色体上定位了1个贡献率为9.7%的干物质含量QTL。Khu等（2008）以四倍体马铃薯抗环腐病与易感环腐病杂交后代 92个基因型为分离群体，将一个重要的贡献率为 43%的抗环腐病 QTL定位在第11号染色体上，同时检测到了一个较小的贡献率为12%的抗环腐病QTL；McCord等（2011）以四倍体马铃薯亲本及全同胞子代 163个基因型为作图群体，构建了两个亲本的连锁图谱，即易发生热坏死生理病害品种大西洋13个连锁群，抗热坏死B1829-5品系14个连锁群，并将抗热坏死QTL定位在第4、5、7连锁群上，且1个SSR标记与两个群体的热坏死症状紧密关联。

我国关于马铃薯农艺性状与品质性状基因定位的研究较少，金黎平（2006）以二倍体为材料，通过AFLP和SSR标记，采用区间作图和多QTL复合作图方法对4种加工及农艺性状进行了QTL定位及遗传效应分析，在亲本遗传图谱的10个连锁群上，共检测到39个QTL。其中控制炸片颜色的QTL 19个，控制干物质含量的QTL 13个，控制单株结薯数的QTL 7个，没检测到控制单个块茎质量的QTL。单友蛟等（2010）以二倍体为材料，通过SSR标记与复合区间作图法对马铃薯块茎相关的3 个重要农艺性状进行QTL定位和遗传效应分析，结果在第5条染色体上检测到控制3个块茎性状的QTL各1个，其中控制单株产量的QTL 遗传贡献率为12.3%，控制单薯质量的QTL遗传贡献率为16.1%，控制块茎比重的QTL遗传贡献率为11.2%。

2.3 分子标记辅助育种

分子标记辅助育种（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）是现代分子生物学与传统育种相结合，借助分子标记对育种材料在DNA水平上早期有目标地进行选择，避免了依赖于表型特征间接推断其基因型，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。与传统的根据基因型反映出来的表型性状选择相比，分子标记辅助育种具有在早期世代和植株生长的任何阶段进行，SSR分子标记共显性的特点可以在杂合体阶段鉴定隐性基因，对目标基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点，尤其是针对处于杂合状态的同源四倍体马铃薯更为重要。

Bormann等（2004）以易感晚疫病品种Leyla为父本，分别以较强田间抗性的Escort（含有特异基因R1、R2、R3、R10）和 Nikita（至少含有特异基因R1）品种为母本，分别在两个杂交后代F1分离群体中选取熟性且对晚疫病抗性不同的84、95个基因型，利用定位在连锁群上（除第10个连锁群外）的30个基于PCR的标记对筛选，根据田间熟性评价和对晚疫病抗性鉴定结果，认为熟性、抗晚疫病基因标记在Nikita后代群体对表型贡献率为38%，而对Escort后代表型贡献率仅为15%，这与其母本的遗传差异有关，并提出了分子辅助选择的实验性方案。Carrasco等（2009）设计了持久抗晚疫病分子辅助选择育种策略，即通过高通量标记将主效R基因或晚疫病抗性QTL导入骨干育种材料中，其程序主要分为：第一，将对抗晚疫病贡献率大的数量性状基因PiXspg精细定位；第二，转换基于SNP和AFLP标记为易于应用的标记；第三，对存在R基因的子代综合评价晚疫病抗性和农艺性状；第四，将新的抗性资源通过回交方式导入马铃薯，利用与晚疫病抗性基因Rpi-phu1紧密连锁的标记GP94对育种材料进行筛选；第五，在田间进行评价马铃薯无性系对晚疫病抗性的提高程度；第六，通过倍性培育抗性群体和筛选标记完善分子辅助抗病性育种。Wickramasinghe等（2009）以具有晚疫病抗性的二倍体杂交后代分离群体为研究材料，以3个分子标记OPA17559（距对晚疫病抗性贡献率为23.4%的QTL 12 cM）、OPA03576、GP198F-1（来源于RFLP标记GP198，与对晚疫病抗性贡献率为23.4%的QTL紧密连锁），经筛选发现它们的存在与晚疫病抗性高度相关，认为这3个标记对分子标记辅助选择抗晚疫病育种非常有效。Moloney等（2009）将对抗马铃薯白线虫变种Pa2/3贡献率大的一个数量位点GpaIVsadg定位在第5连锁群上，在含该位点的C1992/31育种材料和易感品种Record杂交的F1群体中锁定该目标位点，利用与该位点紧密连锁SSR标记STM3016和SNP多态性C237（119）筛选回交子代的 178个基因型，结果表明，分子标记辅助策略对选择持久、高抗马铃薯白线虫变种Pa2/3品种有效。Sagredo等（2009）在71个育种亲本（其中30个具有一定程度的抗性，17个携带RYSC3标记）组配杂交组合后代中，利用与高抗马铃薯Y病毒Ryadg基因连锁的序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）标记RYSC3进行分子标记辅助选择，发现在3个不同组合共460个子代中有299个基因型含RYSC3标记且抗Y病毒，除一个选择不准确外；在不含RYSC3标记其他群体中有22.5%表现为抗Y病毒，可能存在其他R抗性基因。结果表明，在选育高抗马铃薯Y病毒品种过程中，采用RYSC3标记辅助选择含Ryadg基因的子代是有效性的，达到97.7%。

3 展望

栽培马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物，为四体遗传，其规律非常复杂。马铃薯育种过程中存在许多困难，包括细胞高度杂合性、基因分离复杂、花粉不育、杂交不亲和、现有栽培种基因库狭窄、缺乏抗病和抗逆基因。马铃薯种质资源中 75%以上为二倍体野生种，通过孤雌生殖诱导双单倍体和2n配子等方法将优良品质和抗病基因导入栽培种，再利用分子标记辅助选择策略丰富拓宽基因库和加速培育优质高抗（抗病、抗虫、抗逆）品种。与其他分子标记技术相比，SSR分子标记技术是一种较为快捷、简单、稳定的遗传标记，通过将质量性状和数量性状基因的精细定位，开发出大量与之紧密连锁的SSR标记，其在马铃薯遗传育种研究中的应用前景将更加广阔。

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