竹叶花椒黄酮粗提液纯化工艺及抗氧化性研究

周孟焦，何鑫柱, ，李朝俊, ，梁晓峰,

1. 四川中医药高等专科学校川西北中药材资源研究与开发利用实验室（绵阳 621010）；2. 西南科技大学材料与化学学院（绵阳 621010）

竹叶花椒（Zanthoxylum armatumDC），长期以来被认为是花椒的野生品种，与花椒相比，具有更多的风味成分，其活性成分丰富，药理作用广泛，可直接食用或以调料入味，或用于医药行业，随着竹叶花椒种植面积的不断增加，迫切需要拓宽竹叶花椒在其他行业的应用[1-4]。研究表明，竹叶花椒果皮中含有丰富的活性物质，黄酮含量在竹叶花椒活性物质中占比大，具有抗氧化[5]、抑菌[6]、抗衰老[7]、免疫调节[8]等多种药理作用。从竹叶花椒中提取天然黄酮类化合物有助于提高对其药用价值的认识，对高效开发竹叶花椒资源的转化利用具有重要意义。

聚酰胺树脂和大孔吸附树脂被广泛应用于黄酮类物质的纯化精制。聚酰胺树脂富含酰胺基团，分离和脱色效果好。大孔吸附树脂为网状结构，性质稳定、吸附容量大。二者吸附机理决定其对活性物质的纯化方面存在差异，将其联用可充分发挥两者优势，提供一种高效的纯化方法[9-12]。

试验以芦丁为对照品，利用分光光度法测定纯化后样品的总黄酮含量；研究聚酰胺和大孔吸附树脂对竹叶花椒黄酮的吸附和解吸能力，在单因素试验基础上利用响应面试验优化聚酰胺-大孔吸附树脂联用纯化黄酮的工艺参数，并对其体外抗氧化活性进行初步评价，以期为竹叶花椒黄酮的深入研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹叶花椒（产地四川绵阳，干燥备用）。

芦丁（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚酰胺（0.250~0.600 mm，即30~60目，D101大孔吸附树脂，上海麦克林生化科技股份有限公司）；无水乙醇（分析纯，成都科隆化学品有限公司）。

1.2 仪器与设备

XH-MC-1型实验室微波合成仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；BSA124S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；UV-315紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.3 方法

1.3.1 竹叶花椒黄酮粗提液的制备

取适量干燥竹叶花椒，乙醇溶液为提取溶剂，放入实验室微波合成仪中，设置提取条件，石油醚除去脂溶性杂质，即得竹叶花椒粗提液。

精密量取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL 0.2 mg/mL的芦丁溶液于7支试管中，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]，在510 nm处对竹叶花椒提取物含量进行测定。得到芦丁标准曲线线性回归方程A=0.79C+ 0.001 57，R2=0.999 6。

1.3.2 树脂预处理

1.3.2.1 聚酰胺预处理

将聚酰胺在95%乙醇中搅拌10 h，洗去乙醇后在5 mol/L氢氧化钠中搅拌5 h，水洗至流出液pH 7，在5 mol/L醋酸溶液中搅拌5 h，水洗至流出液pH 7[14]。

1.3.2.2 大孔吸附树脂预处理

将大孔吸附树脂在95%乙醇搅拌24 h，洗去乙醇后在5%氢氧化钠溶液中搅拌24 h，水洗至流出液pH 7，经5%盐酸溶液搅拌24 h，水洗至流出液pH 7[15]。

1.3.3 单因素试验

在层析柱中加入一定比例的聚酰胺和大孔吸附树脂，以蒸馏水为填充溶剂，精密量取一定浓度的竹叶花椒黄酮提取液加入层析柱中，水洗，以一定体积分数的乙醇为洗脱液，设置洗脱条件，收集洗脱液，测定流出液吸光度，计算黄酮浓度，按（1）和（2）计算树脂的吸附率和解吸率。

式中：Q为树脂吸附量，mg/g；C0为竹叶花椒黄酮粗提液质量浓度，mg/mL；C1为经树脂吸附后乙醇中黄酮质量浓度，mg/mL；M为树脂质量，g；C2为乙醇溶液中竹叶花椒黄酮浓度，mg/mL；V1为乙醇溶液体积，mL。

聚酰胺-大孔吸附树脂联用法的单因素试验设计见表1。

表1 单因素试验条件

1.3.4 响应面试验

响应面试验的因素和水平见表2。

表2 响应面因素水平表

1.3.5 竹叶花椒黄酮体外抗氧化活性研究

按文献[3]的方法，以芦丁和维生素C为阳性对照，取2 mL不同浓度的竹叶花椒黄酮提取液和2 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液，混匀，黑暗下反应30 min，在517 nm处测定吸光度；以芦丁和维生素C为阳性对照，取2 mL不同浓度的竹叶花椒黄酮提取液和2 mL ABTS溶液，混匀，静置6 min，在734 nm处测定吸光度。根据式（3）计算提取液对自由基清除率。

式中：A0为2 mL无水乙醇+2 mL自由基溶液的吸光度；A1为2 mL竹叶花椒提取液+2 mL自由基溶液的吸光度；A2为2 mL竹叶花椒提取液+2 mL无水乙醇的吸光度。

2 结果与分析

2.1 竹叶花椒黄酮粗提液纯化的单因素试验

2.1.1 聚酰胺与大孔吸附树脂用量比的选择

由表3可知，由于聚酰胺与大孔吸附树脂的结构与性质存在差异，不同树脂用量比对有效成分吸附具有影响，树脂用量比3︰5（g/g）时，树脂对总黄酮的吸附率最高。故选择3︰5（g/g）为竹叶花椒富集纯化的最佳树脂用量比。

表3 聚酰胺与大孔吸附树脂用量比对吸附率的影响

2.1.2 竹叶花椒黄酮粗提液的质量浓度的选择

由图1可知：在1~6 mg/mL质量浓度范围内，随着浓度增加，吸附率上升较快，吸附率在上竹叶花椒黄酮粗提液质量浓度达到6 mg/mL时，可达80.67%，浓度继续增加时，总黄酮在树脂中的因黏度过大而扩散缓慢，杂质在树脂上的吸附增加，同时也会超过树脂的饱和吸附量，使总黄酮得不到充分的吸收，而造成部分黄酮的损失。故选择6 mg/mL为竹叶花椒黄酮粗提液富集纯化的质量浓度。

图1 竹叶花椒黄酮粗提液的浓度对吸附率的影响

2.1.3 竹叶花椒黄酮粗提液流速的选择

由图2可知：竹叶花椒黄酮粗提液流速1.5 mL/min时，树脂吸附率为78.41%，流速继续增加时，树脂吸附率反而降低。流速比较慢时，树脂上的活性位点能充分吸附黄酮，但会降低树脂的吸附效率。流速太快，总黄酮与树脂表面活性部位相互作用时间过短，黄酮还未被树脂充分吸附就会随着溶液，造成损失。故选择1.5 mL/min为竹叶花椒黄酮粗提液富集纯化的流速。

图2 竹叶花椒黄酮粗提液流速对吸附率的影响

2.1.4 树脂洗脱溶剂的选择

由图3可知：树脂洗脱溶剂浓度在20%~60%范围内，树脂对黄酮的解吸率增加明显，解吸率在乙醇体积分数60%时，可达86.67%，随着浓度继续增加，树脂的解吸率开始降低。可能是因为竹叶花椒黄酮粗提液为混合物，目标物更多地溶于60%乙醇溶液而容易被洗脱下来，乙醇体积分数再增加，杂质在高体积分数乙醇中溶解增加随乙醇而流出，故选择体积分数60%乙醇为竹叶花椒富集纯化的洗脱溶剂。

图3 树脂洗脱溶剂浓度对解吸率的影响

2.1.5 乙醇溶液流速的选择

由图4可知：乙醇溶液流速在0.5~2 mL/min范围内，树脂的解吸率比较稳定，洗脱流速2 mL/min时，树脂的解吸率可达77.66%，能将总黄酮较多地洗脱下来，洗脱流速大于2 mL/min，乙醇与黄酮接触不充分就开始流出，大多数黄酮仍吸附在树脂上，降低树脂的洗脱率，故乙醇溶液流速选择2 mL/min。

图4 乙醇溶液流速对解吸率的影响

2.1.6 乙醇溶液收集量的选择

由图5可知：乙醇溶液收集量在2.5~4 BV范围内，树脂解吸率随收集量的增加而提高较快，收集量达到4 BV时，树脂解吸率可达86.16%，超过4 BV时解吸率反而降低。可能是因为洗脱液用量较少时，不能将树脂上的黄酮完全洗脱下来，收集量达到4 BV时，能较多地将黄酮洗脱下来，但乙醇溶液收集量再增加，会将杂质一同洗出，同时也造成洗脱剂的浪费，故乙醇溶液收集量选择4 BV。

图5 乙醇溶液收集量对解吸率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与回归分析

表4的试验结果数据利用Design-Expert 8.05软件对进行统计分析，得到的回归方程为：总黄酮含量Y=86.41-1.70A+1.04B-0.78C+0.26AB+0.56AC-0.052BC- 7.79A2-4.63B2-0.62C2。式中：Y为总黄酮含量；A为树脂用量比，g/g；B为树脂洗脱溶剂，mg/mL；C为乙醇溶液收集量，BV。

表4 响应面试验设计及结果

由表5可知：模型P＜0.001，试验模型极显著，失拟项P=0.385 3，失拟项不显著，模型的决定系数R2=0.994 8，说明方程回归效果好，校正决定系数Radj2=0.988 2，表明模型是可靠的，用该模型分析和预测竹叶花椒总黄酮含量可靠。由F值判断，3个因素影响竹叶花椒总黄酮含量的顺序为A（树脂用量比）＞B（树脂洗脱溶剂）＞C（乙醇溶液收集量）。

表5 方差分析

2.2.2 响应面曲线分析

观察响应面可直观得到变量间交互作用的显著程度，由图6可知，树脂用量比和乙醇溶液收集量的交互作用对总黄酮含量的影响最大，树脂用量比和树脂洗脱溶剂的体积分数的交互作用对总黄酮含量的影响次之，树脂洗脱溶剂的体积分数和乙醇溶液收集量的交互作用对总黄酮含量的影响最小。

图6 两因素交互作用对竹叶花椒总黄酮含量影响的响应曲面（左）和等高线图（右）

2.2.3 验证试验结果分析

在PA与MAR用量比3︰5（g/g）、树脂洗脱溶剂60%、乙醇溶液收集量4.5 BV、其他条件不变的条件下，设置3组平行试验，总黄酮平均含量为87.35%，含量基本稳定，表明该回归模型具有可靠性。

2.3 竹叶花椒黄酮体外抗氧化活性分析

由图7可知，在试验浓度范围内，3种物质清除自由基的能力与自身的质量浓度呈正相关，样品质量浓度较低时对自由基的清除能力不明显，随着质量浓度的增加，其所对应的自由基清除能力也增加。在同一浓度下，各组分对自由基清除率的顺序依次为维生素C＞纯化黄酮＞未纯化黄酮。由此可见竹叶花椒黄酮提取物对DPPH和ABTS自由基的清除能力较强。

图7 竹叶花椒总黄酮对DPPH自由基（上）、ABTS自由基清除能力（下）

3 结论

确定以聚酰胺-大孔吸附树脂联用纯化竹叶花椒黄酮粗提液的最佳工艺参数：聚酰胺与大孔吸附树脂用量比3︰5（g/g）、竹叶花椒黄酮粗提液的质量浓度6 mg/mL、竹叶花椒黄酮粗提液的流速1.5 mL/min、60%乙醇作为树脂洗脱溶剂、乙醇溶液流速2 mL/min、乙醇溶液收集量4 BV，在此条件下总黄酮平均含量为87.35%。聚酰胺、大孔吸附树脂联用对竹叶花椒黄酮类物质有较好的吸附和解吸作用，能够明显减少提取液中杂质，使有效成分含量增多。竹叶花椒黄酮的抗氧化活性虽然低于维生素C，但在一定浓度下具有抗氧化活性，纯化后黄酮抗氧化活性优于纯化前黄酮。后续将进一步研究竹叶花椒黄酮相关指纹图谱、抗氧化性能及其谱效关系，揭示影响其抗氧化性的分子机理，为竹叶花椒的综合开发与利用提供理论支撑。