黑木耳发酵多糖酸奶的研制与工艺优化

舒逸凡，宋克超，徐洁，吴小军，曾晓雄

1. 南京农业大学食品科技学院（南京 210095）；2. 南京思农生物有机肥研究院有限公司（南京 211899）；3. 陕西秦峰农业股份有限公司（商洛 711499）

黑木耳（Auricularia auricula）属真菌类担子菌纲，是一种富含碳水化合物和蛋白质的可食用真菌，主要分布在中国、韩国、日本、泰国等地区[1]。黑木耳具有高营养价值并兼备多种药理功能，其中黑木耳多糖（Auricularia auriculapolysaccharides，AAP）是黑木耳中最主要的活性物质。近年来有许多文献报道称黑木耳多糖具备免疫调节[2]、抗氧化[3]、降血糖[4]、抗肿瘤[5]及抗凝血[6]等生物活性。因此，黑木耳具备较高的开发功能食品的潜力。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是一种源于茯砖茶的曲霉科真菌[7]，作为一种潜在的益生菌，冠突散囊菌可利用多种碳源，尤其能分泌多种胞外酶，如纤维素酶、蛋白酶和多酚氧化酶等，因此也经常被用于谷物和豆类的加工[8-9]。有研究表明在提取多糖的过程中使用真菌发酵能使发酵后的多糖结构多样化，提高其生物活性[10-11]，同时能够提升相关功能性食品品质，改善产品风味、色泽等感官品质，增强其营养价值和保健价值[12]。

对于黑木耳的利用大多停留在粗加工阶段，对于以黑木耳为原料的深加工产品的开发还处于初级阶段[13]。酸奶是一种益生菌发酵食品，其中的益生菌能够代谢黑木耳多糖，形成更小分子的多糖或修饰其结构，产生新的活性功能，增强产品的药理作用，提高活性物质的生物利用度[14]。此外，真菌多糖能够促进乳酸菌的生长，并且减弱消化液对乳酸菌的影响，有利于乳酸菌在宿主体内发挥作用[15]。因此将黑木耳、冠突散囊菌及乳酸菌发酵结合，能使黑木耳深加工产品具备美味、营养、功能多样化等特点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳（陕西秦峰农业股份有限公司）；巴氏杀菌奶、白砂糖（市售）；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌（西安兰杉生物科技有限公司）；冠突散囊菌（MK346334，南京农业大学食品科技学院）[16]；PDB琼脂培养基、MRS琼脂培养基（上海盛思生化科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

AY120电子天平（日本岛津公司）；LRH-150系列电热恒温培养箱（上海恒科学仪器有限公司）；HH-S24S 数显恒温水浴锅；LDZX-50KBS灭菌器（上海申安医疗器械厂）；PEN3型电子鼻（德国AIRSENSE）。

1.3 试验方法

1.3.1 冠突散囊菌的培养

将保存的冠突散囊菌（MK346334）接种于PDB琼脂培养基上，活化培养7 d，待金黄色菌丝长满平板培养基后，用接种环刮取平板上的孢子于无菌水中，使孢子液浓度为1×107CFU/mL，制得孢子悬浮液，备用[17]。

1.3.2 黑木耳发酵多糖的制备

黑木耳发酵多糖的制备参照已报道的黑木耳多糖提取方法[18]。黑木耳经洗净后烘干，用高速粉碎机粉碎成粉末，将黑木耳粉末按照1︰100（g/mL）料液比加入去离子水，在90 ℃水浴条件下浸提3 h，过滤得到黑木耳水提液，经120 ℃灭菌20 min后接种冠突散囊菌（5%冠突散囊菌孢子液），于28 ℃恒温摇床中以120 r/min培养7 d。培养结束后以5 000 r/min离心10 min，上清液真空浓缩至合适体积，加4倍体积乙醇沉淀，沉淀复溶、透析，浓缩、冻干即为黑木耳发酵多糖。

1.3.3 黑木耳多糖的电子鼻分析

称取1 g多糖样品于20 mL顶空瓶中，将密封好的顶空瓶置于50 ℃水浴锅中平衡30 min，插入电子鼻探头测定多糖样品香气。电子鼻参数：冲洗时间60 s，调零时间10 s，样品准备时间5 s，检测时间120 s，内部流量300 mL/min，进样流量300 mL/min。

1.3.4 黑木耳发酵多糖酸奶的制作

原料乳→调配（加入1%发酵多糖和6%白砂糖）→杀菌（62~65 ℃灭菌30 min）→冷却至40 ℃后接种（加入质量分数5%的活化菌种）→密封保温发酵（42 ℃发酵8 h）→后熟（转移至4 ℃冰箱保存12 h）

1.3.5 酸奶乳酸菌活菌数测定

取1 g后熟12 h的酸奶样品，加入9 mL无菌生理盐水混合均匀制得10-1的样品均匀稀释液，依次进行类比稀释，制备10倍系列稀释样品匀液，分别选取0.1 mL 10-5，10-6和10-7这3个梯度的稀释液在MRS固体培养基上涂布，在37 ℃条件下培养48 h后计数，做3次平行测定[19]。

1.3.6 酸奶持水力测定

准确称定空离心管的质量并记为m0，将后熟的酸奶置于离心管中，准确称其质量记为m1，以3 500 r/min离心10 min，离心后静置10 min，除去上清液后准确称量其质量并记为m2。持水力按照式（1）计算[20]。

表1 电子鼻各传感器对应敏感物质

1.3.7 单因素试验设计

以多糖添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、发酵时间（6，8，10，12和14 h）和白砂糖添加量（2%，4%，6%，8%和10%）为自变量设计单因素试验，并对其进行感官评定。

1.3.8 正交试验优化黑木耳发酵多糖酸奶工艺

在单因素试验基础上，分别以不同的多糖添加量、发酵时间以及白砂糖添加量为考察因素，进行感官评定评分，采用三因素三水平正交试验确定酸奶工艺的最优比，正交因素水平见表2。

表2 黑木耳发酵多糖酸奶优化正交试验因素与水平

1.3.9 感官评分

优选10位审评人，参照酸奶感官评分标准（表3），从色泽、组织状态、气味与口感风味方面对黑木耳发酵多糖酸奶进行感官评分，评分满分为100分。

表3 黑木耳发酵多糖酸奶感官评分标准

1.4 数据统计分析

试验数据均重复测定3次，用平均值±标准差形式表示，数据差异显著性采用SPSS（statistical package for social sciences）进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 黑木耳发酵多糖的制备及其香气成分探究

图1显示冠突散囊菌对黑木耳提取液的发酵过程。结果表明，在发酵第2天开始出现白色的冠突散囊菌球状菌丝体，在发酵第5天菌丝体直径可达5~6 mm，在发酵第7天发酵液出现浑浊现象，可能存在菌丝体的自溶，因此在第6天终止发酵。发酵结束后离心，上清液经浓缩、醇沉等步骤得到黑木耳发酵多糖。

图1 冠突散囊菌发酵黑木耳提取液过程

电子鼻从50 s之后传感器响应值趋于稳定，因此选择50 s时的电子鼻响应值进行分析。图2（A）为发酵前后多糖样品的主成分分析（PCA）分析结果，PCA1和PCA2的贡献率分别为74.44%和14.72%，解释度为89.16%，说明PCA分析具有可行性。PCA分析结果表明发酵前样品和发酵后样品香气特征具有显著性差异（P=0.013），因而通过冠突散囊菌发酵显著改善黑木耳多糖的香气。结合电子鼻雷达图（图2B）结果可知，发酵前后挥发性香气成分差异主要体现在传感器W2W、W1W、W1S、W5C、W3C和W1C，经发酵后的黑木耳多糖芳香族化合物、有机硫化物、无机硫化合物、萜烯类化合物和碳氢化合物香气成分增加，芳香烃类化合物、氨类化合物和短链烷烃芳香化合物香气成分减少，而在其余传感器响应值基本汇于一点，说明它们对应香气特征物质较为相似。含硫化合物和烃类化合物作为食用菌常见的挥发性物质，对食用菌的风味形成有很大影响，两者与其他风味物质互补调和，呈现食用菌的特殊香气[21]，而这2类化合物香气成分含量在发酵后上升，说明冠突散囊菌发酵能改善黑木耳多糖的香气成分。

图2 多糖样品电子鼻主成分分析（A）和雷达图（B）

2.2 黑木耳发酵多糖添加量对酸奶乳酸菌活菌数的影响

乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群，保持微生物平衡，提高食物的消化率和生物价，降低血清胆固醇和体内毒素，抑制肠道腐败菌的生长和腐败物质的产生[22-23]。黑木耳发酵多糖添加量对酸奶乳酸菌活菌数的影响如图3（A）所示。结果表明在酸奶发酵过程中添加黑木耳发酵多糖能促进乳酸菌的增殖，添加量达到1.0%时，酸奶的活菌数最高。添加量继续增大，乳酸菌活菌数趋于平稳或呈下降趋势，可能原因是过量的多糖导致发酵过程中体系的水分活度下降，影响乳酸菌的生长[24]。

图3 黑木耳发酵多糖对酸奶乳酸菌活菌数（A）和持水量（B）的影响

2.3 黑木耳发酵多糖添加量对发酵酸奶持水力的影响

酸奶的持水力会影响酸奶的组织状态、稳定性及口感。测定的酸奶持水力结果如图3（B）所示。多糖添加量达到0.5%时，酸奶的持水力达到最大，说明适当的黑木耳发酵多糖能在发酵过程中与酪蛋白分子相互作用，强化蛋白质的网状结构，可以容纳水分和小分子物质，减少乳清的析出，从而增加酸奶的持水力，改善发酵乳的品质[25]。添加量大于1.0%时，酸奶的持水力开始显著下降，说明过量的黑木耳发酵多糖会降低酸奶的持水力，可能是高浓度的多糖会破坏发酵乳凝胶的微观结构从而导致水分流出和乳清的析出[26]。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 黑木耳发酵多糖添加量对酸奶感官评分的影响

按照不同添加剂量添加黑木耳发酵多糖后，通过感官评定评价黑木耳发酵多糖对酸奶品质的影响，结果如图4所示。随着黑木耳发酵多糖添加量的增大，酸奶的颜色逐渐加深，黑木耳发酵多糖添加量达到2.0%时，酸奶组织状态明显下降，出现分层现象，可能是牛奶中的蛋白与多糖在发酵过程中发生美拉德反应，通过共价键连接在一起，形成共价络合物，从而观测到两相，即高浓度高分子络合物为一相，另一相是水[27]。根据图4（B）感官评分结果显示，黑木耳发酵多糖添加量0~1.0%时，随着添加量增大，酸奶的感官评分呈现上升趋势，添加量大于1.0%后，随着添加量继续增大，感官评分呈现下降趋势，其中添加量1.0%时，酸奶色泽均匀、组织状态细腻，发酵乳风味浓郁，伴随黑木耳发酵多糖的独特风味，口感良好，酸甜度适中。

图4 黑木耳发酵多糖添加量对酸奶的感官影响

2.4.2 发酵时间对酸奶感官评分的影响

发酵时间对酸奶的感官评分的影响结果如图5（A）所示。发酵时间为8和10 h时，感官评分最高。发酵时间短会造成发酵乳风味不够浓郁，而发酵时间过长会使酸奶过酸。

2.4.3 白砂糖添加量对酸奶感官评分的影响

白砂糖添加量对酸奶感官评分的影响结果如图5（B）所示。白砂糖添加量6.0%时，酸奶酸甜适中，感官评分最高，白砂糖添加量过低或过高会导致酸奶风味过酸或过甜。

图5 发酵时间（A）和白砂糖添加量（B）对酸奶感官评分的影响

2.5 正交试验结果与分析

黑木耳发酵多糖酸奶正交试验结果如表4所示。根据极差R大小可知影响黑木耳发酵多糖酸奶的因素重要性顺序：A＞C＞B，即影响最大的因素为黑木耳发酵多糖添加量，其次是白砂糖添加量，最后是发酵时间。由均值大小可知酸奶的最佳的工艺为黑木耳发酵多糖添加量1.0%，发酵时间9 h，白砂糖添加量8%。

表4 黑木耳发酵多糖酸奶正交试验表

3 结论

试验以黑木耳为原料，经冠突散囊菌发酵制备黑木耳发酵多糖，结果发现得到的黑木耳多糖香气特征成分更加丰富；以乳酸菌活菌数、持水力、感官评分等指标，探讨黑木耳发酵多糖对乳酸菌酸奶的发酵及其品质的影响，结果表明添加适量的黑木耳发酵多糖能促进乳酸菌的增殖，提高酸奶的持水力，增加酸奶的稳定性，并且改善酸奶的风味、口感、色泽及组织状态；基于酸奶的乳酸菌活菌数、持水力及感官品质指标，通过单因素试验和正交试验确定黑木耳发酵多糖酸奶的最佳工艺：黑木耳发酵多糖添加量1.0%，发酵时间9 h，白砂糖添加量8%。新型黑木耳产品的研发有助于提升黑木耳的深加工水平，提高黑木耳的附加价值，有助于我国黑木耳产业步入转型发展的新时期。