玉米低聚肽制备条件优化

李秋红，夏颖颖，崔强, ，孙学谦, ，李树，夏尚磊,

1.山东西王糖业有限公司技术中心（邹平 256209）；2.山东省玉米生物加工循环经济工程技术研究中心（邹平 256209）；3.山东大学海洋学院（威海 264209）

玉米低聚肽粉是以玉米蛋白为原料，用酶（蛋白酶）解法生产，以相对分子质量小于1 000的低聚肽为主要成分的粉末状产品。玉米低聚肽营养丰富，有易吸收、易溶解、热稳定、天然安全等优点，被广泛应用于食品[1]、保健品[2]、工业制造、烟草制品、化妆品、饲料[3]、医药[4-5]等领域。国外对肽类的研究较多，早在20世纪40年代就已出现有关肽类应用的研究报道[7-9]。在国内，玉米低聚肽的研究起步较晚，但是发展迅速[10-13]。随着基因组研究工作深入发展，玉米肽的研制及开发生产成为各大领域新兴产业的发展方向。国内外玉米低聚肽研究均以烘干后的蛋白粉为原料，经过高温烘干后的蛋白粉用蛋白酶水解后，水解度较低。为提高蛋白水解度并实现蛋白在玉米淀粉生产线上完成水解的目的，试验以玉米湿蛋白为原料，采用适合生产条件的酸性蛋白酶，对影响蛋白酶作用的因素进行研究优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米湿蛋白（山东西王糖业有限公司）；酸性蛋白酶（118 000 U/mL，百斯杰生物工程有限公司）；HCl、NaOH（山东宏川化工有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

JOAN 1 mL移液枪（杭州天裕化工仪器）；PHB-3 pH计（上海三信仪表厂）；WAY-ZT阿贝折光仪（上海精科仪器厂）；BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；DK-98-Ⅰ四孔电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；JJ-1定时电动搅拌器（江苏市中大仪器厂）；J-E离心机（美国贝克曼）；KDY-04C定氮仪（北京金北德工贸有限公司）；GX-05A高速万能粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；60目（约0.250 mm）不锈钢筛（新乡市千振机械有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米湿蛋白前处理

取淀粉厂过滤板框工段玉米湿蛋白滤饼，用高速万能粉碎机粉碎，过0.250 mm（60目）筛，筛下物备用。

1.3.2 水解度（DH）的计算[14]

式中：N0为反应前玉米蛋白液中可溶性蛋白含量，%；N1为酶解后酶解液中可溶性蛋白含量，%；N2为玉米湿蛋白中总蛋白含量，%。蛋白含量用定氮仪检测。

1.3.3 底物浓度对DH的影响

玉米湿蛋白和纯水按一定比例添加，配制干基底物浓度分别为5%，10%，15%和20%的溶液，pH 3.8（玉米湿蛋白加水后pH，未调节），加酶量10%（干基质量），反应温度50 ℃，搅拌，反应周期24 h。水解结束后料液以5 000 r/min、15 min离心处理，测定离心上清液蛋白含量。

1.3.4 反应pH对DH的影响

玉米湿蛋白干基质量浓度10%，pH分别调节为3.5，3.8，4.0和4.5，加酶量10%（干基质量），反应温度50 ℃，搅拌，反应周期24 h。水解结束后料液以5 000 r/min、15 min离心处理，测定离心上清液蛋白含量。

1.3.5 蛋白酶加酶量对DH的影响

玉米湿蛋白干基质量浓度10%，pH 3.8，加酶量分别为玉米湿蛋白干基质量的3%，5%，8%，10%，12%和15%，反应温度50 ℃，搅拌，反应周期24 h。水解结束后料液以5 000 r/min、15 min离心处理，测定离心上清液蛋白含量。

1.3.6 反应温度对DH的影响

玉米湿蛋白干基质量浓度10%，pH 3.8，加酶量10%，反应温度分别设置为40，45，50，55，60和65℃，搅拌，反应周期24 h。水解结束后料液以5 000 r/min、15 min离心处理，测定离心上清液蛋白含量。

1.3.7 反应周期对DH的影响

玉米湿蛋白干基质量浓度10%，pH 3.8，加酶量10%，反应温度50 ℃，搅拌，反应周期分别为6，12，18和24 h。水解结束后料液按5 000 r/min、15 min离心处理，测定离心上清液蛋白含量。

1.3.8 正交试验

根据单因素试验结果，底物浓度、pH、加酶量、反应温度和反应周期选择不同的水平，见表1，对玉米湿蛋白的水解条件进行优化。

表1 正交试验设计L16(45)

2 结果与讨论

2.1 底物浓度对DH的影响

由图1可以看出，随着反应底物浓度的增加，蛋白酶对玉米湿蛋白的水解度降低，可能是因为玉米湿蛋白不可溶，在反应体系中以混悬状态存在，随着底物浓度的增加，体系流动性较差，不利于蛋白的分散，酶与底物的接触概率也逐渐减少，使得相同的反应周期内，底物浓度越高的体系，酶对蛋白的水解度越低[15]。虽然底物浓度低有利于提高酶对蛋白的水解度，但是底物浓度高，单位时间内处理的原料越多，产品收率高，有利于产能的增加，经济效益就越高。综合考虑经济效益和酶的水解效率，最终选定的合适的底物浓度为10%。

图1 底物浓度对DH的影响

2.2 反应pH对DH的影响

由图2可以看出，pH在3.5~3.8范围内，随着pH的升高，蛋白酶对蛋白的水解程度增加，pH 3.8左右时，蛋白酶对玉米湿蛋白的水解效率最好，水解度可达50.6%。但是pH高于3.8时，随着pH的升高，酶的水解效率降低，说明pH与酶的活性密切相关。生产过程中的玉米湿蛋白混悬液pH一般在3.5~4.0之间，所以为了完成玉米蛋白的在线分解，使得酶适应玉米蛋白生产线，酶解过程采用酸性蛋白酶，过程中可以不用调节pH，既可节约辅料投入成本，又能减少后续净化工序的负担。

图2 pH对DH的影响

2.3 蛋白酶加酶量对DH的影响

由图3可以看出，反应底物浓度10%时，随着加酶量的增加，单位物料接触到的蛋白酶越多，对蛋白的水解速度和效率增加，所以加酶量越高，玉米蛋白的水解程度越高。但是蛋白酶的售价普遍较高，加酶量增加，意味着酶投入成本增加。综合考虑酶成本与水解度，最终选定的玉米蛋白水解的加酶量为10%，此时水解度可达51.6%。

图3 加酶量对DH的影响

2.4 反应温度对DH的影响

由图4可以看出，随着温度的升高，酶的运动速度增加，与蛋白接触的概率增加，玉米蛋白的水解度增加，反应温度50 ℃时水解度达到最高53.6%。反应温度45~50 ℃时水解度变化不大，但是温度继续升高时，维持温度所需的能耗增加，并且酸性蛋白酶的酶活失效加快，玉米湿蛋白的水解度反而降低。所以确定玉米蛋白的水解温度50 ℃为宜。

图4 反应温度对DH的影响

2.5 反应周期对DH的影响

由图5可以看出，反应周期越长，蛋白酶对蛋白分子的作用时间越长，玉米湿蛋白的水解程度越高，说明酸性蛋白酶对玉米蛋白的水解效率比较低下，需要靠反应时间的延长增加水解度。但是反应周期的延长会增加相应的能耗。综合考虑节能降耗和蛋白水解度，最终确定的反应周期为24 h。

图5 反应周期对DH的影响

2.6 正交试验结果

由表2可以看出，各个因素对水解度的影响从大到小：加酶量＞底物浓度＞反应周期＞反应温度＞反应pH，最优组合为加酶量10%，底物浓度6%，反应周期28 h，反应pH 3.6，反应温度50 ℃。

表2 正交试验结果

2.7 正交试验结果验证

验证试验共进行3次，以正交试验最优组合为反应条件，对玉米湿蛋白进行水解反应，最终水解度分别为72.29%，72.24%和72.30%，均高于正交试验最高结果71.12%，说明经过试验研究得到的最优水解条件结果可靠。

3 结论

以玉米湿蛋白为原料，采用酸性蛋白酶进行水解，最优的水解条件为加酶量10%，底物浓度6%，反应周期28 h，反应pH 3.6，反应温度50 ℃。此条件下得到的蛋白水解液干物浓度12.5%，水解液中蛋白含量60.72%，玉米湿蛋白水解度72.30%。水解液脱苦、脱色后[16]，可溶性蛋白提纯、冷冻干燥[17-19]，可得到玉米低聚肽产品。