Box-Behnken响应面法优化五味子醇甲提取工艺

艾佳佳，黄慧芝，刘海燕，侯春久，汤灿辉，陈文

1.江西中医药高等专科学校（抚州 334400）；2.临川区第一人民医院（抚州 334400）

五味子临床用于治疗肝炎、抗肿瘤及抗病毒等[1]，是由于其含有木脂素类成分[2]，其中以含量较高，具有联苯木脂素的五味子醇甲为代表。五味子醇甲提取工艺中，采用最频繁的方法为加热回流提取法，该提取工艺较为成熟，但存在一些不足，如提取时间长、消耗能源大及操作较繁琐等[3]。

超声提取法是一种采用超声波能量，破坏植物药材的细胞，并帮助溶剂进入细胞内，溶解天然药物化学成分的一种提取方法。该方法操作简单，成本较低，高效便捷[4]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-M20A型检测器、CTO-20A型柱温箱、SIL20A型自动进样器，日本岛津公司）；MS105DU型分析天平（梅特勒托利多有限公司）；BAS2202S型电子天平（赛多利斯公司）；KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

五味子醇甲对照品（含量99.7%，批号110857-201815，中国食品药品检定研究院）；五味子（江西中医药高等专科学校附属医院）；β-环糊精（批号20201007，天津市大茂化学试剂厂）；无水乙醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。

1.3 试验方法

1.3.1 五味子醇甲含量测定分析方法的建立

1.3.1.1 含量测定方法

1.3.1.1.1 色谱条件的确定

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（13︰7）为流动相，检测波长250 nm[6]。

1.3.1.1.2 标准溶液的配制

取适量五味子醇甲对照品，精密称定，加甲醇制备成每1 mL含1 514.00 μg的标准储备液。

1.3.1.1.3 供试品溶液的配制

五味子打粉，精密称取，置于10 mL容量瓶中，加甲醇，定容，超声，至五味子充分溶解，补充甲醇，至刻度，过滤，取续滤液，即得。

1.3.1.2 含量测定方法学考察

1.3.1.2.1 线性关系考察

取五味子醇甲对照品母液，分别精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，取0.45 μm微孔滤膜，过滤，取续滤液，注入高效液相色谱仪，检测。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，进行线性回归，其回归方程为y=29.571x+3 410.9，R2=0.998 8。

1.3.1.2.2 精密度考察

取10 μL同一对照品溶液，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，五味子醇甲对照品溶液SRSD为0.88%，说明高效液相仪器精密度良好。

1.3.1.2.3 稳定性考察

取同一供试品溶液，常温放置，分别于0，2，4，8，12和24 h进样分析，注入液相色谱仪进样分析，SRSD为0.79%，说明稳定性良好，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

1.3.1.2.4 重复性考察

按上述供试品溶液配制方法制备，平行制备6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪进样分析，计算得出五味子醇甲含量SRSD为0.89%，说明该方法重复性良好。

1.3.1.2.5 加样回收率考察

精密吸取6份10 mL含量相同的供试品，精密加入10 mL五味子醇甲对照品，混合均匀，注入液相色谱仪进样分析，SRSD为0.55%。

1.3.2 响应面法优化五味子醇甲提取工艺

1.3.2.1 五味子醇甲的提取

将五味子粉碎过筛，加入一定量的β-环糊精，与一定量的溶剂混匀，超声提取，提取液过滤。

1.3.2.2 单因素试验

通过查阅文献[6]，并进行预试验考察，选取乙醇体积分数、β-环糊精加入量、提取时间3个因素作为自变量，五味子醇甲提取率作为因变量。各因素的水平梯度设置：乙醇体积分数为40%，60%，80%和100%；β-环糊精加入量为0，10%，15%和20%；提取时间为10，20，30，40和50 min。根据试验结果选出主要影响因素，根据响应面法设计五味子醇甲提取工艺，建立最优工艺。

1.3.2.3 Box-Behnken试验设计

在单因素试验考察基础上，依据各因素对五味子醇甲提取率的影响，选取适当的自变量，以五味子醇甲提取率为评价指标，采用Design Expert试验设计软件进行试验，依据试验结果拟合二次多项式方程，并建立响应面模型，预测最佳五味子醇甲提取工艺及五味子醇甲提取率。试验因素及各水平见表1。

表1 五味子提取工艺响应面试验因素与水平

1.3.2.4 最优处方验证

根据Design Expert软件所给出的最优提取工艺预测各因素的最优值，计算五味子醇甲提取率，与软件所给出的预测值对比，验证软件的准确性。

2 结果与分析

2.1 HPLC色谱图

五味子醇甲对照品、五味子醇甲样品色谱图，见图1。由图1（a）可知，五味子醇甲在保留时间8.234 min出现色谱峰。由图1（b）可知，样品中含有五味子醇甲，且在保留时间8.363 min出现色谱峰。

图1 HPLC色谱图

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对五味子醇甲提取率的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数增大，五味子醇甲提取率增大，乙醇体积分数80%，五味子醇甲提取率达到最大。乙醇体积分数继续增加，五味子醇甲提取率反而减少。因此，选择80%乙醇作为响应面中心点。

图2 乙醇体积分数对五味子醇甲提取率的影响

2.2.2β-环糊精加入量对五味子醇甲提取率的影响

由图3可知，随着β-环糊精加入量的增加，五味子醇甲提取率增加，当β-环糊精加入量为10%时，五味子醇甲提取率达到最大，继续增加β-环糊精的质量，五味子醇甲提取率反而降低。因此选择10%β-环糊精加入量为中心点。

图3 β-环糊精加入量对五味子醇甲提取率的影响

2.2.3 提取时长对五味子醇甲提取率的影响

由图4可知，随着提取时间延长，五味子醇甲提取率增加，当提取时间达到30 min时，五味子醇甲提取率保持稳定。故选择30 min作为响应面提取时间中心点。

图4 提取时间对五味子醇甲提取率的影响

2.3 五味子醇甲的提取工艺优化

2.3.1 响应面设计结果

运用Design-Expert 8.0.6对表2中试验结果进行多元线性回归及二项式拟合，得到二项式拟合方程：Y=0.68-0.021A+0.021B+0.014C-0.014AB-0.012AC-8.672×10-3BC-0.027A2-0.019B2-2.468×10-3C2。

表2 提取工艺试验设计及结果

由表3可知：该模型P=0.015 7＜0.01，表明模型显著；失拟项P＞0.05，表明模型拟合度良好。由方差分析可知，自变量1次项A、B以及二次项A2显著（P＜0.05），表明该模型具有统计学意义。

表3 提取工艺方差分析

固定三个变量之一为中值，绘制提取率的效应曲面图。由图5可知，与C方向比较，B效应面更陡，说明β-环糊精对五味子醇甲提取率的影响要大于提取时间。各因素的交互作用，由图5~图7等高线的形状及响应曲线的陡峭程度可以得出，各因素的相互作用不显著。

图5 β-环糊精加入量与提取时间对五味子醇甲提取率影响的等高线图与响应曲面图

图6 乙醇体积分数与提取时间对五味子醇甲提取率影响的等高线图与响应曲面图

图7 乙醇体积分数与β-环糊精加入量对五味子醇甲提取率影响的等高线图与响应面图

2.3.2 提取工艺条件优化预测

运用Design-Expert 8.0.6软件优化所得的五味子醇甲最优提取工艺为乙醇体积分数72.40%、β-环糊精含量12.98%、提取时间40.00 min，五味子醇甲提取率为0.71%。

2.4 验证试验

依据响应面优化的最佳条件进行验证试验，在其他因素固定不变的条件下，按照最优提取工艺预测：乙醇体积分数72.40%、β-环糊精含量12.98%、提取时间40.00 min，五味子醇甲提取率为0.689%，0.701%和0.698%（n=3），SRSD值分别为0.25%，0.37%和0.46%，表明该验证试验的结果可靠、准确。

3 结论

试验以乙醇体积分数、超声时间、β-环糊精加入量为考察因素，以五味子醇甲提取率为评价指标，采用Box-Behnken设计-效应面法对提取条件优化，建立多元线性模型，并绘制效应面图，得到最优提取条件。验证五味子醇甲最优提取条件，试验数据表明，最优提取条件能明显提高五味子醇甲提取率。此次试验为五味子醇甲提取率相关影响因素的探究提供理论依据和工艺参考。