确定性筛选设计优化钙DK咀嚼片工艺及稳定性因素研究

张美萍，李晓慧，牛健，陈超，田密

北京振东光明药物研究院有限公司（北京 100085）

钙维生素DK咀嚼片是以钙、维生素D3（VD3）、维生素K2（VK2）为原料制成的营养素补充剂，可以防治骨质疏松[1]和血管钙化[2-3]。钙是维持骨骼健康的主要营养素，对预防和治疗骨质疏松症起到重要作用[4]。维生素D3能够增加肠道钙吸收，维持机体钙平衡[5]。维生素K2可以活化骨钙蛋白与钙离子结合，刺激成骨细胞分化、促进骨形成[6-7]，此外还具有改善血管钙化等作用[8-9]。

钙维生素DK咀嚼片制备工艺：原辅料混合→湿法制粒→干燥→整粒→总混→压片→包装。

湿法制粒[10]得到的颗粒粒径如果相差太大，会影响产品混合效果，从而影响营养素的含量均匀性，同时还会造成压片过程中片重不稳；总混工艺同样会影响产品中营养素的含量均匀性，制粒和总混是产品生产过程中的关键工艺，需要重点考察和控制。

相较于正交设计和响应面设计在考察因素较多的情况下，需要的试验次数较多[11]，试验选用的确定性筛选设计（definitive screening design，DSD）[12]能够仅用较少的试验次数实现对10个因素的筛选和优化，极大地节省试验成本[13-14]。此产品中含两种脂溶性维生素VD3、VK2，其化学性质极不稳定，与钙配伍时，其稳定性是产品开发的极大挑战[15-16]。此次试验考察了糖醇添加量、颗粒水分、光照、氧气对产品稳定性的影响，为产品的商业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2 000 ppm维生素K2（德国Gnosis）；0.25%维生素D3（厦门金达威生物科技有限公司）；0.015 mm碳酸钙（上海诺诚药业股份有限公司）；山梨糖醇（保龄宝生物股份有限公司）；麦芽糊精、聚维酮K30、二氧化硅（安徽山河药用辅料股份有限公司）；三氯蔗糖（山东三和维信生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

SYH-10三维运动混合机（常州市高强干燥设备有限公司）；HS-200三维运动混合机（江苏星星干燥设备有限公司）；HLSG-10P高效混合制粒机（浙江明天机械有限公司）；FG-50沸腾干燥机（江苏国朗机械制造有限公司）；C&C800旋转式压片机（北京创博佳维科技有限公司）；Xse205分析天平（Mettler）；Waters e2695高效液相色谱（Waters科技有限公司）；PinAAcle900T原子吸收光谱仪（Perkein Elmer）；Labonce-250GS稳定性试验箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）；HX/HS快速水分测定仪（梅特勒-托利多有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 产品湿法制粒辅料及工艺优化

共选择3个辅料变量和2个工艺变量（表1）用于确定性筛选试验设计，每个变量设置3个水平，以颗粒合格率（0.250 mm＜d＜0.850 mm）为响应，利用JMP 13.0软件DSD进行实验设计。

表1 制粒DSD因素和水平

将碳酸钙、麦芽糊精、山梨糖醇混合均匀后，添加聚维酮K30溶液（添加量为混合粉质量的15%）进行制粒，湿颗粒置于沸腾干燥机中（温度50~55 ℃）干燥，干颗粒用筛分法测定粒径分布。

1.3.2 产品总混工艺优化

根据1.3.1小节筛选出的最佳配方和工艺制粒，制得的干颗粒与VD3、VK2、三氯蔗糖、二氧化硅混合。共选择1个辅料变量和4个工艺变量（表2）用于确定性筛选试验设计，每个变量设置3个水平，以VD3混合均匀度变异系数为响应值。VD3混合均匀度变异系数（C.V.）通过同一批次10个样品中VD3含量的平均值（X）和标准差（S）计算得到[17]，C.V.值越大，混合均匀度越差。均匀度变异系数按式（1）计算。

表2 混合DSD因素和水平

1.3.3 产品最优配方及工艺验证

根据DSD筛选的最优配方及工艺参数放大3批进行验证（56 kg/批），检测其颗粒合格率、VD3混合均匀度及含量、钙含量、VK2含量[18]，并对片剂感官、脆碎度和片重差异进行检测。VD3含量检测方法：《中国药典 四部 2020版》；钙含量检测方法：GB 5009.92[19]。

1.3.4 影响产品稳定性因素考察

1.3.4.1 不同山梨糖醇添加量对VD3、VK2稳定性影响

将山梨糖醇添加量分别调整为0，10%，20%，30%和40%，麦芽糊精添加量分别对应为40%，30%，20%，10%和0，制得干颗粒后与其他原辅料混合均匀，压片（1.0 g/片），用白色塑料瓶密封包装，置于稳定性箱（温度37±2 ℃，相对湿度75%±5%）3个月，分别于0，1，2和3月检测VD3和VK2含量，并计算稳定性，每个试验重复3次。稳定性按式（2）计算。

式中：W0为0月维生素含量，μg/片；Wn为加速后维生素含量，μg/片；n为1，2和3月。

1.3.4.2 不同颗粒水分对VD3、VK2稳定性影响

将制粒后的湿颗粒干燥水分分别控制在2%，5%，8%和11%时得干颗粒，其余步骤参照1.3.4.1小节进行稳定性考察。

1.3.4.3 不同包装条件对VD3、VK2稳定性影响

将制备的样品分别置于白色塑料瓶、棕色塑料瓶、透明塑料瓶、白色塑料瓶（加脱氧剂）密封包装，参照1.3.4.1小节进行稳定性考察。

1.3.5 数据处理

每组数据结果以平均值±标准误差表示，采用SPSS 23.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 产品湿法制粒辅料及工艺优化

根据表3试验设计对聚维酮K30溶液浓度、麦芽糊精添加量、山梨糖醇添加量、制粒时间和干燥时间进行优化，以颗粒合格率为评价指标，试验结果如表3所示。

表3 制粒DSD试验设计及结果

对以上试验数据进行向前逐步多元回归，按式（3）计算。

模型的R2为0.953，P为0.001 4，说明该模型拟合较好且显著（P＜0.01）。结果显示，聚维酮K30溶液浓度（X1）和制粒时间（X4）对颗粒合格率有影响但不显著（P＞0.05），而X1与X4有显著的二阶交互作用（P＜0.01），此外X1的二阶平方项也显著影响（P＜0.01）。结果显示X1与颗粒合格率负相关，X4与颗粒合格率正相关。聚维酮K30浓度过高会导致粉末黏性过大，摇摆制粒时不易成粒且粘筛网，造成颗粒合格率下降。制粒时间延长能够提高原辅料的黏性，黏合剂用量也应相应降低，在制粒时不能忽略两者的交互作用而单独调整其中一个参数。根据DSD优化结果，聚维酮K30溶液浓度（X1）为14.4%，制粒时间（X4）为300 s时，颗粒合格率最高。

2.2 产品总混工艺优化

姜艳喜等[20]发现粉体颗粒的水分一定程度上影响颗粒间的黏着力及颗粒与容器壁的附着力，从而影响混合效果。利用DSD试验设计对颗粒水分、二氧化硅添加量（润滑剂）、装载系数、混合转速和混合时间进行考察和优化，以VD3混合均匀度变异系数（C.V.值）为评价指标（VD3添加量最小为0.25%），C.V.值越小说明混合均匀性越好。试验结果如表4所示。

表4 总混工艺DSD试验设计及结果

对以上试验数据进行向前逐步多元回归，按式（4）计算。

模型的R2为0.957，P为0.000 6，说明该模型拟合较好且显著（P＜0.01）。结果显示装载系数（X8）和混合时间（X10）对混合均匀性有显著影响（P＜0.01），此外X10的二阶平方项也显著影响（P＜0.01）。结果显示X8与混合均匀性负相关，X10与混合均匀性正相关。在产品商业化生产中装载系数过小，混合时间较长会导致产品生产成本增加，在满足产品混合均匀性前提下，应适当提高装载系数，减少混合时间，以缩短产品生产周期。根据DSD优化结果，装载系数（X8）为0.4，混合时间（X10）为22 min时，VD3混合均匀性最好。

2.3 产品最优配方及工艺验证

按照DSD优化得到的最优配方及工艺参数（表5），进行3批次产品验证，结果见表6。

表5 优化配方及工艺参数

表6 验证试验结果

按照表5参数设计进行3批产品工艺放大验证，结果显示（表6）：3批产品的颗粒合格率均良好，与拟合结果吻合，能够满足压片要求；C.V.值均不超过5%，证明混合均匀性良好；功效成分钙、VD3、VK2含量均合格；感官、脆碎度及片重差异均符合要求，说明经过优化后的产品工艺稳定，质量合格，能够用于大生产。

2.4 影响产品稳定性因素考察

2.4.1 不同山梨糖醇添加量对VD3、VK2稳定性影响

糖醇类辅料因在制剂中能与大多数原料配伍、可压性好、口感好等优势被广泛应用于片剂中[21]。但糖醇具有引湿性，可能对产品的稳定性产生一定的影响。山梨糖醇不同添加量对VD3、VK2稳定性的影响结果见表7。

表7 山梨糖醇不同添加量VD3、VK2稳定性结果（n=3）

由表7数据可知，山梨糖醇添加量对片剂中VK2稳定性影响较大，添加量与VK2稳定性呈负相关。添加量为0和10%时，加速3个月稳定性分别为91.21%和89.23%，两者无显著性差异（P＞0.05），这与Orlando等[16]的研究结果基本一致：VK2与碳酸钙配伍加速3月稳定性超90%。添加量高于10%时，均显著影响了VK2含量稳定性，而山梨糖醇的添加量对VD3稳定性影响较小，原因可能是VD3原料经过了微囊化包埋，而VK2原料未进行包埋导致其稳定性差。侯志远等[22]认为可以通过原辅料相容性试验排除与VD3有作用的辅料，得到的辅料可以成为VD3的“保护伞”，改善VD3在复方固体制剂中的稳定性，此产品中麦芽糊精相比山梨糖醇更能够对VK2起到“保护”作用，可适当降低山梨糖醇的添加量，这也提示企业在进行同类产品开发时，应注意糖醇类辅料对VK2稳定性的影响。

2.4.2 不同颗粒水分对VD3、VK2稳定性影响

水分是很多化学反应的介质，过多的水分会软化维生素微粒，增加氧气和水分的渗透性，破坏维生素稳定性[23]。制粒工艺中黏合剂溶液的添加是引入水分的主要途径，颗粒经过干燥可以去除大部分水分，试验通过控制干燥时间将颗粒水分分别调整到2%，5%，8%和11%，以考察水分对VD3、VK2稳定性的影响，结果如表8所示。

表8 不同颗粒水分VD3、VK2稳定性结果（n=3）

由表8数据可知，颗粒的含水量对片剂中VD3和VK2稳定性都有影响，水分含量与稳定性呈负相关。颗粒水分为2%和5%时，加速3个月VD3和VK2稳定性均能达到80%以上，稳定性较好，两者无显著性差异（均P＞0.05），颗粒水分含量高于5%时，加速3月后VD3和VK2稳定性均显著低于颗粒水分为2%时（均P＜0.01）。为了节约能源同时缩短产品生产周期，该产品颗粒干燥水分控制在5%左右即可。

2.4.3 不同包装条件对VD3、VK2稳定性影响

Begari等[24]研究发现VK2对光比较敏感，在生产、储存及使用过程中采取适当的避光措施，可以降低VK2的分解率。孙健等[25]将配方粉进行48 h光照后，VK的留存率不足70.0%，建议配方粉包装尽可能选择阻光阻氧的包装材质，以降低光照因素对其产生的影响。此产品不同包装条件对VD3、VK2稳定性影响试验结果见表9。

表9 不同包装条件对产品中VD3、VK2稳定性影响结果（n=3）

利用不同包装条件考察光照、氧气对VD3、VK2稳定性的影响，结果如表9所示。样品分别用白色、棕色、透明塑料瓶包装，VD3经3个月加速稳定性分别为91.34%，91.21%和78.67%，透明塑料瓶3月稳定性显著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照会影响VD3稳定性。棕色与白色塑料瓶相比差异不显著（P＞0.05）。内置脱氧剂对VD3稳定性影响不显著（P＞0.05），可能是因为VD3包埋壁材起到隔绝氧气的作用。VK2经3个月加速稳定性分别为87.39%，88.27%和61.20%，透明塑料瓶3月稳定性显著低于白色塑料瓶（P＜0.01），表明光照同样影响VK2稳定性。棕色与白色塑料瓶相比差异不显著（P＞0.05），说明白色塑料瓶内同样含有遮光物质，能够满足产品对阻光的要求。内置脱氧剂显著改善其稳定性（P＜0.01），表明氧气对VK2稳定性有影响。此产品在生产及储存过程中应尽量避光，企业在成本允许的条件下包装时尽量使用脱氧剂。

3 结论

目前VD3、VK2与钙配伍的产品，混合均匀性和稳定性是两大技术性难题，尤其是VK2稳定性研究方面的报道较少。此研究通过DSD优化了制粒和混合工艺参数，用较少次数的试验完成了共10个变量的优化，经过优化后的产品混合均匀性良好，且经过放大验证能够在工业化生产中应用。同时对影响产品VD3、VK2稳定性的因素进行了考察，提高了产品的稳定性。文章针对这两个问题进行重点研究，研制的产品混合均匀性和稳定性均能符合要求，下一步可对配伍的辅料种类进行重点筛选优化，以得到口味更佳、稳定性更好的产品。