产GABA乳酸菌工艺优化及其产物抗氧化活性研究

施生玲 ，郭星晨 ，马金璞 ，杨雪妍 ，宋礼，高丹丹

1.西北民族大学生命科学与工程学院（兰州 730124）；2.西北民族大学生物医学研究中心，中国-马来西亚国家联合实验室（兰州 730030）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又称哌叮酸[1]，是一种天然的非蛋白质氨基酸，具有改善糖尿病、降血压、免疫调节、舒缓疲劳、改善睡眠和癫痫等[2-4]多种功能，被广泛用于医药、食品等领域。GABA可通过微生物发酵法制备，该方法具有发酵产量的优势。有研究发现，乳酸菌具有产GABA的能力，主要包括短乳杆菌（Lactobacillus brevis）[5]、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）[6]、布氏乳杆菌（Lactobacillus brucei）[7]、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）[8]等。由于乳酸菌独特的益生特性和安全性，采用乳酸菌生产GABA成为当前研究热点，不仅具有极大的市场应用前景，还具有很高的学术研究价值。

试验从甘肃本地牧民家中自制牦牛酸奶筛选出产GABA的乳酸菌，通过对比不同接种量、碳源、氮源、pH和发酵时间，探究乳酸菌产GABA的最佳条件，利用Box-Behnken响应面分析法优化乳酸菌产GABA的发酵工艺条件，分析发酵产物的抗氧化活性，为产GABA乳酸菌功能性产品的开发提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸奶（甘肃省甘南藏族自治州牧民自制牦牛酸奶）；DPPH、γ-氨基丁酸（色谱纯，美国Sigma公司）；L-谷氨酸钠（L-Glu，BR，索莱宝化学试剂有限公司）；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器设备

ZWYR-2401恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；L3S可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SG2-FK便携式pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；GNP-9050恒温培养箱（湖南波仪尔科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 产GABA乳酸菌的筛选鉴定

1.3.1.1 乳酸菌菌株的筛选

将适量酸奶接种于MRS液体培养基，于37 ℃进行扩大培养24 h，将菌液进行10倍梯度稀释至10-3~10-8，在MRS固体培养基上进行涂布法接种，接种量为100 μL，于37 ℃培养48 h。挑取有溶解圈的菌落，在固体培养基上进行划线接种，直至产生单一菌落，将菌株于4 ℃条件储存备用。

1.3.1.2 乳酸菌菌株的鉴定

将纯化的1.3.1所述的菌落形态的产GABA的菌株按照革兰染色试剂盒说明书进行染色，用光学显微镜观察其细胞特征。

1.3.1.3 培养液产GABA的定性和定量的分析

采用纸层析法定性测定GABA。参考万玉莲[9]方法操作并加以修改，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水4∶1∶3（V/V），其中加入0.4%的茚三酮[10]。采用Berthelot比色法定量分析GABA[11]。

1.3.2 产GABA乳酸菌发酵工艺优化

1.3.2.1 单因素试验设计

以MRS液体发酵培养基（含L-谷氨酸钠）为基础，以GABA产量为指标，考察不同接种量（1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%）、不同碳源（可溶性淀粉，麦芽糖，乳糖，葡萄糖和蔗糖）、不同pH（4.5，5.0，5.5，6.0和6.5）、不同时间（24，36，48，60和72 h）对乳酸菌GABA产量的影响。每组试验重复3次，最终结果取平均值。

1.3.2.2 响应面试验设计

综合单因素试验结果，以GABA产量（Y）为响应值，pH（A）、接种量（B）和时间（C）为自变量，设计三因素三水平试验，运用Box-Behnken进行响应面试验设计。响应面试验设计因素和水平见表1。

表1 响应面设计因素水平表

表2 4株菌株菌落形态描述

1.3.3 GABA抗氧化活性的测定

1.3.3.1 羟自由基清除率测定

参考陈嘉佳等[12]的方法操作并加以修改，羟自由基的清除率按式（1）计算。

式中：P为羟自由基清除率，%；A0为空白组吸光度；A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的测定

参考陈明[13]的方法操作并加以修改。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

1.3.3.3 超氧阴离子自由基清除率测定

参考李丹丹[14]的方法测定超氧阴离子自由基的清除率，按式（2）计算。

式中：P为超氧阴离子自由基清除率，%；A0为空白组吸光度；A1为试验组吸光度。

1.3.4 数据分析

采用Origin 9.0、Design-Expert 8.0软件进行数据统计分析，每次试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 产GABA乳酸菌的筛选鉴定

2.1.1 乳酸菌菌株的分离纯化

将乳酸菌菌株接种在MRS固体培养基37 ℃培养48 h后，培养基中出现明显的碳酸钙溶解圈（图1），挑选单一菌落进行培养，菌落形态如图1所示，乳酸菌菌落形态为菌落呈圆形，乳白色不透明，湿润，边缘整齐。

图1 菌株形态图

2.1.2 乳酸菌菌株的鉴定

对菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4进行革兰染色，革兰染色结果呈现蓝色，均为革兰阳性菌，菌株呈短杆状，如图2所示。

图2 革兰染色结果图

2.1.3 培养液产GABA的定性和定量分析

2.1.3.1 层析法定性测定GABA

从图3可以看出：初筛出的4株菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4都产有与标准品GABA相同的Rf值，说明4株菌株都产GABA，菌株XBMU436-2颜色最深，说明菌株XBMU436-2产生的GABA含量最高，因此，以菌株XBMU436-2为试验菌株。

图3 纸层析法试验结果图

2.1.3.2 Berthelot比色法定量分析GABA

试验采用Berthelot比色法检测GABA含量，试验得到线性关系Y=0.742 4X+0.012 8（R2=0.999）。试验菌株测定结果如图4所示。菌株XBMU436-2的培养液产的GABA含量最高，其产量为1.80 g/L。

图4 初筛菌GABA含量测定图

2.2 高产GABA乳酸菌发酵工艺优化

2.2.1 单因素试验结果

2.2.1.1 接种量、碳源、pH、发酵时间对乳酸菌GABA产量的影响

如图5（a）所示，接种量1.5%~2.5%时，GABA含量呈上升趋势，接种量2.5%时，GABA含量最高，为3.51 g/L，接种量大于3.0%时，GABA含量开始下降。因此，选用接种量2.5%为菌体生长中的最佳接种量。

图5 接种量、碳源、pH和发酵时间对乳酸菌GABA含量的影响

如图5（b）所示：菌株对不同碳源的利用程度具有一定差异性，测得以葡萄糖为唯一碳源时乳酸菌产GABA最多，为5.44 g/L，即菌株对葡萄糖的利用程度较好，其原因是可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和蔗糖为多糖，多糖为微生物提供能量则需要先分解，而葡萄糖是单糖，单糖与其他麦芽糖等多糖比起来，可直接为微生物提供营养物质。因此，选择葡萄糖作为菌体生长中的最佳碳源。

如图5（c）所示：在pH 5.0~6.0时，GABA含量呈上升趋势，pH 6.0时，GABA含量最高，为3.14 g/L，但超过pH 6.0时，GABA含量开始减少，呈现直线下降趋势。培养基pH对微生物的影响很大，pH的大小会引起细胞渗透性的变化和各种酶的活性，从而影响微生物的生长和对营养物质的利用程度，使得乳酸菌产GABA的产量不同。因此，选用pH 6.0为菌株生长的最佳pH。

如图5（d）所示：培养时间为24~48 h时，GABA含量呈现上升趋势，48 h时，GABA产量最高，为5.19 g/L，60 h以后GABA含量开始呈现下降趋势，因此，选用48 h为菌体生长中的最佳培养时间。

2.2.2 响应面分析法优化发酵工艺

2.2.2.1 回归模型的建立和方差分析

在单因素试验基础上，选取pH、接种量和时间这3个因素，进行三因素三水平试验设计，用响应面分析法优化发酵工艺条件，根据中心Box-Behnken组合原理设计17组试验，其中，5组为重复试验，结果如表3所示。

表3 Box-Behnken试验设计与结果

利用软件Design-Expert 8.0，对表3结果进行一系列回归分析，对pH、接种量和时间3个单因素进行回归拟合，得到以GABA产量（A）为响应值的回归方程：Y=3.91-0.16A+0.38B+0.31C-0.12AB-0.19AC+0.063BC-0.55A2-0.59B2-0.67C2。

回归方差分析如表4所示。

表4 回归方差分析和结果

试验结果如表4所示，显著性检验表明该回归模型的拟合极显著（P＜0.01），失拟项（P＞0.05）不显著。模型与实际拟合较好（R2=0.968 6，Radj2=0.927 2），表明模型拟合度可靠性强，观察值与预测值之间的相关性良好，该模型可用于优化GABA发酵培养基。

2.2.2.2 响应面分析及优化

图6是单因素pH、接种量和时间交互作用3D响应面和等高线图，2个因变量相互作用对GABA产量的影响在3D响应面图中均表现为光滑的弯曲面，弯曲度越大，证明两变量之间相互作用越强。如图6（a）所示，在pH一定时，随着接种量的增加，培养液中GABA产量先增加后减少，响应曲面弯曲度较小；如图6（b）所示，pH一定时，随着培养时间的增加，培养液中GABA产量先增加后减少，响应面曲面弯曲度较小；如图6（c）所示，接种量一定时，随着培养时间的增加，培养液中GABA产量先增加后减少，响应面曲面弯曲度较小。

图6 pH、时间和接种量交互作用对GABA含量的影响及等高线图

2.3 GABA抗氧化活性的研究

2.3.1 羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除率的测定

如图7所示：发酵液质量浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL时，发酵液对羟自由基、DPPH、超氧阴离子自由基的清除率逐渐增大，三种自由基的清除率在发酵液质量浓度为0.5 mg/mL时最大。图7（a）显示，菌液对羟自由基清除率为80.64%±0.39%，IC50=0.12 mg/mL，同等条件下，VC的清除率为92.85%±0.30%，IC50=0.03 mg/mL；图7（b）显示，菌液对DPPH自由基清除率为57.55%±0.54%，IC50=0.52 mg/mL，同等条件下，VC对超氧阴离子清除率为85.44%±0.34%，IC50=0.10 mg/mL；图7（c）显示，菌液对超氧阴离子自由基清除率为83.83%±0.20%，IC50=0.20 mg/mL，同等条件下，VC对自由基的清除率为88.59%±0.15%，IC50=0.14 mg/mL。以VC为标准，GABA对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基有一定清除能力。

图7 羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除率的测定结果

3 结论

试验从牦牛酸奶中筛选出4株产GABA乳酸菌，菌株XBMU436-2产GABA最多，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化其工艺发酵条件，最终确定发酵培养基培养条件：以葡萄糖为唯一碳源、pH 6.0、接种量2.5%、时间36 h，经过优化后GABA产量达4.11 g/L，相比于优化前有很大提升，证明响应面分析法可有效优化乳酸菌产GABA的工艺条件。通过对培养液抗氧化活性的研究，其培养液对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子的IC50分别为0.12，0.52和0.20 mg/mL，同等条件下，VC对羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子的IC50为0.03，0.52和0.14 mg/mL，证明培养液具有一定的抗氧化能力。试验结果为产GABA乳酸菌功能性产品开发提供一定基础。