辣木叶酵素的配方优化及品质分析

杨昆，潘新杰, ，陶亮，黄艾祥*

1. 云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）；2. 潍坊工程职业学院（潍坊 262500）

辣木（Moringa oleifera）又称鼓槌树（Drumstick tree），是辣木科辣木属植物，最早起源于印度的喜马拉雅山南麓[1]。辣木营养丰富，且深受人们的喜爱。据报道，辣木叶子干粉中每100 g中含有27.1%的粗蛋白、2 000.30 mg钙、368 mg镁、204 mg磷、1 324 mg钾、0.60 mg铜、282 mg铁，以及163 mg维生素A、30.7 mg维生素B、173 mg维生素C、113 mg维生素E[2-4]。辣木在印度、非洲等地有“素食黄金”[5]之称，已被作为高营养价值的蔬菜开发利用[6]。

酵素，广义上是一种酶，狭义上是指具有丰富的有益菌及代谢产物酶、维生素、活性物质等营养成分的功能性微生物发酵产品。酵素一般是微生物发酵一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等原料，这样不仅保存了原料中原有的营养物质，而且还通过发酵代谢产生新的活性物质[7]。

目前，酵素是一种风靡日本和我国台湾的植物功能食品，我国大陆地区对酵素的研究甚少，主要开发的产品有木瓜酵素、糙米酵素、火龙果酵素等，都起到了很好的保健作用。董银卯等[8]研究发现火龙果酵素具有很强的超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基清除能力，酵素内SOD活力为300 U/mL，并且也有一定的淀粉酶和脂肪酶的活性。李志江等[9]以糙米为主要原料经微生物发酵制成的糙米酵素，提高了糙米的食用特性和功能特性。蒋增良[10]研究发现蓝莓酵素在发酵过程中抗氧化性能明显提高。

辣木叶是一种高蛋白、高钙、富含活性成分的乔木类新资源食品，但蛋白质等营养成分利用率低，微生物发酵是提高其利用率的有效途径。辣木叶酵素具有一定的开发利用前景，而有关辣木叶酵素的研究等未见文献报道。因此，以辣木叶粉为主要材料，通过微生物发酵剂发酵，筛选最佳的工艺配方，并对酵素产品质量进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

1.1.1 试验材料

辣木叶粉：50 μm直径的辣木粉和超微辣木叶粉，购自昆明七彩云花生物科技有限公司；脱脂奶粉：市售。

辣木叶发酵剂（通过对四株酵母菌进行梯度驯化，以及蛋白质、草酸降解等指标筛选得到热带假丝酵母；乳酸菌为实验室已驯化的植物乳杆菌、干酪乳杆菌共2株，参考潘新杰[11]的研究）。

1.1.2 主要试剂

MRS培养基，北京陆桥；麦芽汁培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；麦芽提取粉，广东环凯微生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），青岛科园海博生物技术有限公司。

1.1.3 仪器与设备

数显恒温水浴锅（HH-6），国华电器有限公司；超声仪（KRU-1800），济南科尔超声波设备有限公司；高速冷冻离心机（H2100R），上海赵迪生物科技有限公司；恒温恒湿箱（MGG-300H），上海一恒科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

辣木叶粉→加纯净水浸泡→添加辅料→加水溶解→均质→巴氏灭菌→冷却→接种乳酸菌→培养→接种热带假丝酵母菌→培养→冷却→后熟→成品

1.2.2 发酵剂的选择

参照潘新杰[11]的方法，确定发酵剂的接种比例为m（植物乳杆菌）：m（干酪乳杆菌）：m（酵母菌）=3：3：1；乳酸菌和酵母菌的总接种量为3%。

1.2.3 单因素试验

选取奶粉添加量（5%，10%，15%，20%和25%）、辣木叶粉添加量（10%，15%，20%，25%和30%）、白砂糖添加量（20%，25%，30%，35%和40%）、藕粉添加量（9%，17%，25%，33%和41%）为单因素，以感官评分为指标进行单因素试验。

1.2.4 正交试验设计

以奶粉、辣木叶粉、白砂糖、藕粉添加量为四因素，设计L9(34)正交试验，确定最佳的产品配方。因素和水平见表1。

表1 主要原料组成及其添加量的L9(34)正交试验因素水平表 单位：%

1.2.5 复合稳定剂的选择

试验通过查阅资料以及多次试验筛选，最后采用黄原胶（0.010%，0.015%和0.020%）、魔芋胶（0.05%，0.15%和0.25%）为复合稳定剂，并同时添加配合大豆软磷脂2.4%、β-环状糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%，研究其配比对辣木酵素质地的影响。

1.2.6 产品质量分析

1.2.6.1 感官评定标准

由表2可知，辣木酵素的感官质量由感官评定小组进行评定，评定小组由9位有关的专业人士组成。根据产品的色泽、气味、口感、组织状态几个方面进行感官评分，评分为百分制，综合结果取平均值。

表2 感官评定表

1.2.6.2 产品活菌数

在MRS固体培养基中添加10 mg/L的纳他霉素和1 000 mg/L山梨酸钾来抑制酵母菌的生长[12]。在改良的酵母菌固体培养基（PDA）中添加氯霉素，能够排除乳酸菌生长对酵母菌总菌数检测的干扰，采用稀释平板计数法（国标）测定乳酸菌和酵母菌总活菌数。

1.2.6.3 产品酶及活性物质

1.2.6.3.1 总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定

SOD的提取：量取15 mL混匀发酵液，按7 000 r/min离心过滤，取上清液备用（50 μL）。SOD的测定：南京建成生物工程SOD试剂盒

1.2.6.3.2 过氧化氢酶（CAT）活力的测定

过氧化氢酶的提取：准确量取15 mL混匀发酵液，按7 000 r/min离心过滤，取上清液备用。

过氧化氢酶的测定：南京建成生物工程过氧化氢酶试剂盒。

1.2.6.3.3 谷胱甘肽（GSH）的测定

谷胱甘肽（GSH）的提取：准确量取15 mL混匀发酵液，按7 000 r/min离心过滤，取上清液备用。

谷胱甘肽（GSH）的测定：南京建成生物工程谷胱甘肽（GSH）试剂盒。

2 结果与分析

2.1 辣木酵素的配方筛选

2.1.1 单因素对辣木酵素感官评分的影响

由图1所示，当奶粉添加量为15%，辣木叶粉添加量为20%，白砂糖添加量为35%，藕粉添加量为17%时，四者可以获得最高的感官评分。

图1 单因素对辣木酵素感官评分的影响

2.1.2 正交试验结果

由表3可知，根据极差分析结果，4种主料添加量对辣木酵素感官品质的影响：最主要的因素是辣木叶粉添加量，其次是奶粉添加量，再是白砂糖添加量，即影响辣木酵素感官品质的顺序为B＞A＞C＞D。由此可知，辣木酵素配方中4种主料的最优组合为A2B3C1D2，即奶粉15%、辣木叶粉20%、白砂糖35%、藕粉17%。按该配方组合进行3次平行试验加以验证，产品的感官评分的均值为97.00分，制得的辣木酵素，色泽呈淡绿色，具有辣木特有的清香，呈半固体状，实物感强，口感爽滑，风味浓郁，因此，选择A2B-3C1D2组合为最佳配方。

表3 主要原料配比L9(34)正交试验结果

2.1.3 复合稳定剂选择

辣木酵素中辣木叶粉是辣木叶经过烘干、超微粉碎制成，含有大量的不溶性纤维素及二价离子，会造成体系稳定性较差，必须外加胶体物质及磷酸盐以帮助形成悬浮稳定体系。黄原胶和卡拉胶形成凝胶网络悬浮结构，可防止不可溶的颗粒沉降，配合大豆软磷脂、β-环状糊精、抹茶香精和酸奶香精赋予酵素较好的香味和细腻爽滑口感。结果见表4。

表4 稳定剂的添加量对辣木酵素质地的影响

由表4可知，5号即黄原胶3%、魔芋胶7%、大豆软磷脂2.4%、β-环状糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%为最佳的复配稳定剂，按该复配量进行3次平行验证试验，产品的稳定性较好，可有效解决辣木酵素分层、辣木过稠等现象，使产品达到最佳口感。赵谋明等[13]研究表明，黄原胶是由微生物发酵产生的杂多糖类物质，黄原胶在水中溶解时，能形成一种共聚体，这种共聚体构成类似胶体网状结构，能够抓取乳剂中不溶颗粒和油脂分子，能够使乳液的粒度和Zeta保持不变，对乳剂中不溶性颗粒和油脂分子的液滴具有良好的稳定作用。浮吟梅等[14]研究表明：卡拉胶是一种亲水胶体，能够在乳剂中与蛋白质发生作用，形成三维空间网状结构，网状结构可以结合并固定水分子和不溶颗粒，卡拉胶分子带有负电荷，能够吸附在油脂分子表面，增加油脂分子的排斥力，从而起到稳定作用。由此可见，稳定剂的添加对辣木酵素的质地显得尤为重要。

2.2 最佳配方工艺流程

由表5可知，通过单因素和正交试验，筛选最佳的工艺配方和复配稳定剂，并结合筛选的微生物发酵剂发酵，得到最佳的工艺技术。

辣木超微粉碎粉20%→加纯净水浸泡（1：1）1 h→添加辅料（奶粉15%、藕粉17%、白砂糖35%、黄原胶3%、魔芋胶7%、大豆软磷脂2.4%、β-环状糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%等混匀）→加水溶解（料液比1：10 g/mL）→均质→巴氏灭菌（80℃，15 min）→冷却→接种乳酸菌（干酪乳杆菌、植物乳杆菌各1.29%）→培养3 h→接种热带假丝酵母菌0.42%→培养15 h→冷却→后熟4 h→成品

表5 辣木酵素研制的最佳工艺流程

2.3 酵素产品质量

2.3.1 感官品质

由表6可知，辣木酵素呈良好的半固态，黏度适中，无絮状分层现象；色泽鲜亮、爽目，呈均匀一致的淡绿色，不透明；风味浓郁飘香，奶香味中带有辣木味，气味协调，无异味；口感细腻润滑，味道柔和，酸甜适中。感官评分为87.375分。莫大美等[15]通过研究获得了玫瑰酵素的最佳工艺，利用该工艺制备的玫瑰酵素具有玫瑰红色和玫瑰花味，淡淡酒香、酸甜适宜。南竹等[16]对菠萝皮渣酵素发酵工艺的研究表明，当发酵温度23 ℃、酵母接种量0.3%、发酵时间16.5 h时，制得的酵素颜色均匀，有光泽，酸甜适口，并伴有发酵香味。由此可见，此次研究的酵素产品感官品质较好，酸甜适中，味道柔和。

2.3.2 功能活性成分

由表7可知，发酵组均大于未发酵组，SOD酶活性达4 520.79 U/g，CAT活性达3.522 U/g，GSH活性达48.026 mg GSH/g。通过增长百分比可以看出过发酵后的SOD酶活性、过氧化氢酶活性及谷胱甘肽含量增长百分比分别为55.41%，128.70%和77.53%，其中过氧化氢酶发酵后增长量最大。通过活菌数指标可以看出乳酸菌活菌数达8.91×108CFU/mL，酵母菌活菌数达4.76×106CFU/mL，与复合发酵辣木液的活菌数相比，酵母菌和乳酸菌均有不同程度的增大。

目前，食用酵素中被研究最多的活性酶主要包括SOD（超氧化物歧化酶）、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶四类，尤以SOD为代表。SOD活性已成为抗衰老药物和抗衰老保健食品的一个重要指标[17]。林冰等[18]对刺梨酵素、梁贵秋等[19]对桑葚酵素、刘鑫等[20]对蓝莓酵素也获得了相同的结论。说明微生物发酵均能产生SOD。除此之外，酵素还有很多的功能作用，比如改善肠胃功能[21]、治疗腹泻[22]、抗压与抗疲劳[23]等。然而，研究的辣木酵素不仅含有SOD，还含有过氧化氢酶、谷胱甘肽、乳酸菌、酵母菌等丰富的功能活性成分。

表7 辣木酵素的活性成分表

3 结论

筛选得到辣木叶酵素的最佳工艺配方：辣木叶粉的添加量为20%，1：1加水浸泡1 h，添加辅料为80%，乳酸菌和酵母菌的总接种量为3%。由此工艺生产的辣木酵素产品呈淡绿色半固态状，酸甜适中有辣木清香，含有丰富的益生菌、酶及活性成分。通过对辣木叶酵素的研制，可为后续辣木产品的深加工，提供理论依据，并提高辣木的附加值及促进辣木产业的发展。