高浓度啤酒酿造特性的研究概况

崔云前，孟飞，杜俊杰，吉春晖，周长生

1. 齐鲁工业大学生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室（济南 250353）；2. 菏泽聚鑫源食品有限公司（菏泽 274400）

高浓度啤酒需要利用高浓度的麦汁（麦汁浓度≥15 °P）及高耐性的酵母进行酿造，而且普遍将高于18 °P麦汁浓度的啤酒称为高浓度啤酒，酒精含量大于5%vol的啤酒称为高酒精度啤酒[1]。虽然其酒精度略微偏高，但风味独特、营养丰富、口感上佳，具有十分高的饮用价值。在高浓度啤酒酿造中，啤酒酵母是重要因素，直接影响成品啤酒的品质。酵母在高浓度麦汁发酵过程中会受到多个因素的影响，包括发酵初期高浓度的糖含量及低溶氧、发酵后期的高酒精含量等，这些均会影响酵母的生理状态和发酵性能，造成啤酒的口感及品质不佳。此外，高浓度麦汁的制备和发酵过程的控制等对高浓度啤酒的品质也起着至关重要的影响。

近几年，精酿啤酒在国内蓬勃发展，中高端啤酒的销售量持续增长，啤酒消费者对产品的品质与创新性的要求不断增高。不过考虑到酿造技术及生产成本的原因，我国生产的啤酒仍然以中低端、口感清淡（原麦汁浓度≤15 °P）为主，高浓度啤酒占小部分市场，啤酒种类也相对单一。以高麦汁浓度、高酒精含量啤酒为主的高端市场被国外啤酒所占据。因此，若要增强国内啤酒在中高端市场的竞争力，对醇厚浓烈、种类多样的高浓度啤酒的研究有重要意义。

1 高浓度发酵对酵母的影响

1.1 对酵母的生理状态影响

在高浓度发酵的整个过程中，发酵初期高浓度的糖分和发酵中后期较高的酒精含量均会对酵母细胞产生较大的渗透压：在发酵前麦汁的渗透压达150 Psi以上，在发酵结束时的渗透压可以到450 Psi以上，酒精含量在6%以上[2]。渗透压的增加会引起环境中水含量降低，所以会造成一定程度的生理干燥。因为较高的酒精含量导致酵母细胞产生严重毒性：酵母细胞膜的通透性会由于高的酒精含量发生改变，使细胞膜对H+的透过性加强，细胞质的pH下降，由此改变了酵母细胞的活性和生理状态，降低了糖代谢能力，细胞的活力也会减弱，细胞的生长得到限制。所以，在高酒精含量及高渗透压的环境影响下啤酒酵母的发酵度、酒精生成量及发酵速度均会随之降低，从而影响经济利润[3]。

1.2 对酵母碳源物质代谢的影响

碳水化合物占麦汁的90%～93%。其中异麦芽糖、戊糖、低聚糊精等不可发酵性糖占26%左右，这些物质不能被酵母分解利用，不过会明显影响到成品啤酒的品质。在约75%的可发酵糖中，葡萄糖、麦芽糖与麦芽三糖的含量最高，依次占有60%～65%，20%～25%与10%～15%，果糖与蔗糖的含量相对来说微乎其微[4]。研究表明，麦汁中糖类每个组分的减少或者增加可能会同时改变麦汁可发酵性糖的比例，从而影响酵母的糖代谢能力[5]。到目前为止，一些啤酒酿造公司普遍都是通过添加适当比例的辅料来制备较高浓度的麦汁，常用辅料包括大米、玉米淀粉及麦芽糖浆等，所以麦汁中糖类的组分发生比较显著的改变。Rautio等[6]研究表明，如果在麦汁中葡萄糖的比例较高，则酵母的麦芽糖转运酶活性会明显地受到抑制，随着葡萄糖与麦芽糖的比例下降，葡萄糖对麦芽糖的阻遏效应会出现减缓，麦芽糖转运酶的活力得到提升。不过在发酵的后期，麦芽糖代谢基因的表达量会迅速下降。研究表明葡萄糖与麦芽糖的比例太大或者太小均会对酵母的糖代谢能力产生一定的负面作用。

1.3 对酵母氮源物质代谢的影响

酵母的发酵性能及啤酒品质的稳定性不能仅仅依靠麦汁中的糖类组分。在啤酒的发酵阶段，酵母还需要利用麦汁里的含氮物质来合成细胞自身的核酸、蛋白质等含氮化合物，进而完成细胞的增殖[7]。不过酵母并不是可以吸收并利用所有的含氮物质。酵母可以吸收并利用的含氮化合物称之为游离氨基氮，即铵离子、小分子肽与游离氨基酸的总称，被视为是在啤酒的酿造中表达酵母可同化氮水平的重要指标[8]。若可同化氮的含量充沛，酵母的降糖速度与增殖速度就会加快，若含量偏少，则会导致酵母提前进入衰老状态。在高浓度啤酒的发酵过程中，需要更多的游离氮用来平衡高渗透压及其他的环境压力，并且加入一定比例的辅料使麦汁中游离氨基氮含量下降，因此对酵母的发酵性能产生影响。所以，在增加麦汁浓度的同时还需要注意游离氨基氮含量的增加，进而使糖代谢能力保持正常，维持较强的细胞活性。Conner等[9]研究得出，在高浓度发酵中的麦汁初始游离氨基氮的含量与酵母的增殖速率有较高的相关性。麦汁中游离氨基氮的含量从160 mg/L增至410 mg/L后，酵母的降糖速率及增殖速率均显著增强，并且酒精的含量增加了约75%。

2 高浓度啤酒酵母的选育

酵母作为啤酒的“灵魂”，对啤酒的风味及品质有着至关重要的影响。酵母在高浓度麦汁中会受到高渗透压和高酒精含量的影响，选育出合适的酵母是进行高浓度啤酒发酵的关键。这类酵母需要拥有较好的耐高酒精含量及耐高渗透压的能力，具有良好的发酵性能，这样才可以确保成品啤酒的风味与品质的稳定性[10]。

目前，很少有与高浓度发酵啤酒酵母选育相关的研究报告，普遍应用的技术包括化学诱变、物理诱变、连续培养选择等方法。凌猛等[11]用啤酒酵母X作出发菌株，以生化方式进行连续筛选，得到耐高酒精含量（18%）、耐高渗透压（糖度60%）的啤酒酵母Y。这个酵母在28 °P高浓度麦汁中进行发酵，发酵度和出发菌株比较增加了3.5%，并且风味的组合也更加协调；Lies等[12]利用高浓度驯化结合紫外诱变技术的方法，得到一株在18 °P高浓度的麦汁中有良好发酵性能的啤酒酵母菌株，12℃发酵结束后酒精度为8.2%vol，比出发酵母菌株增加了5.2%。Huuskonen等[13]采用EMS诱变方法对发酵结束之后的酵母菌株进行处理，接着连续培养选择（持续地往麦汁中加入麦芽糖与麦芽三糖，直到大多数酵母细胞失去活性），所得到的酵母菌株发酵性有明显的改善，它的发酵速度相对于出发菌株增加了10%～30%，发酵得更加彻底，并且酵母的絮凝性和亲代相似。Mizuno等[14]应用培养基筛选的方法，在培养基中加入适量2-去氧-D葡萄糖（2-DOG），然后进行优胜劣汰的选择，最终得到一株可以抑制葡萄糖阻遏效应的酵母菌株，在20 °P的超高浓度麦汁中发酵酒精度可达到9.9%vol，相对于出发酵母菌株增加了12.5%。

虽然以上研究利用诱变技术和连续培养选择等方法，得到的酵母菌株可以进行高浓度啤酒的酿造，不过截至目前，并没有专用酵母可以完全适用于高浓度啤酒的生产。所以，需要尝试对传统的诱变育种等方法进行改进，合理地利用好基因工程技术的优势，潜心于组建适合高浓度啤酒酿造的基因工程菌种探究，期望获得一株耐高渗透压、耐高酒精度、副产物的产率高及稳定性强的酵母菌株，进而实现高浓度啤酒的大规模生产。

3 高浓度麦汁的制备

高浓度麦汁的制备，需要高质量的麦芽才能制备高浓度的麦汁。溶解度好、糖化力强的麦芽，能够将淀粉更佳地水解为可供酵母吸收利用的糖，而且得到的麦汁中含有更高的游离氨基氮。增加游离氨基氮与可发酵性糖含量的同时有效避免酵母细胞活力低造成的发酵缓慢，得到更加高的酒精产量，降低能源消耗、劳动力等，以获得更多的经济利润。

通过研究得出，最佳制备高浓度麦汁的方式有：1）添加各种糖浆以获得高浓度麦汁；2）增加煮沸时间或者增加麦芽的使用量。对于前者，如果在煮沸结束之前加入糖浆，能够很好地避免过滤及搅拌等问题，不过糖浆的种类和添加量会对麦汁品质造成影响，包括使游离氨基氮含量下降及可发酵性糖的比例发生改变。想要获得高浓度的麦汁，需要在增加麦芽使用量时把控好料水比，在煮沸结束之前投入适量的糖浆[10]。后者因为增加了麦芽使用量，导致糊化与糖化醪黏度增加，使过滤与搅拌受阻，并且增加了煮沸时间，加大了能源消耗。

4 高浓度啤酒发酵过程的控制

国内外研究者提出多种通过途径对发酵过程的控制来解决酿造高浓度啤酒的困难，如提高酵母接种量、补充酵母营养物质、调节溶氧量等。Nguyen等[15]研究表明，增加酵母的接种量会使发酵液酵母细胞数得到增加，乙醇生产速率和糖的利用率也会升高，不过啤酒的双乙酰水平也会同时提高。研究结果还显示，只利用增加接种量的方式，要比往麦汁里加入营养物质效果更佳（酵母提取物及吐温80）或者将这两种方法共同进行，糖的摄入量、双乙酰含量、乙醇生产速率及酒精含量均是评价的指标[16]。Erten等[17]表明，增加酵母接种量会使发酵速率加快，2-甲基-1丙醇的含量同时也会增加，而2-及3-甲基-1-丁醇的含量减少。不过Verbelen等[18]研究表明，风味物质的产生没有因接种量受到明显的影响，不过双乙酰的含量会明显增加。

在啤酒的发酵阶段，酵母的生理活性和发酵性能受到溶氧量的显著影响。氧对甾醇及不和饱和脂肪酸的合成有促进作用。并且甾醇是酵母细胞膜的重要成分，充足的麦角甾醇对细胞生长有明显的促进作用，对保持细胞膜的渗透性、流动性以及细胞膜功能的完整性也有显著影响[19]。另外，研究发现线粒体基质中的含锰超氧化物歧化物和酵母对酒精的耐受性有密切联系，然而氧和其合成紧密相关。若在发酵阶段不能对酵母提供充足的氧，对其增殖会造成负面作用，酵母对高酒精度、高渗透压的耐受性下降，进而造成发酵速率下降或减缓。在高浓度啤酒酿造中，因其麦汁浓度的提高，造成麦汁的饱和溶氧量下降，然而相比于常规发酵，高浓度酿造中酵母对氧的需求量更高。因此在高浓度发酵过程中，需要增加麦汁的溶氧量，以确保在酵母增殖期间能够提供充足的氧。Heather等[20]研究表明，如果供氧浓度和时间可以合理有效地控制，发酵周期能够明显缩减，可提高生产效率，降低物质消耗。Rees等[21]分别研究了12 °P麦汁与20 °P麦汁中不同含量的锌离子对酒精含量及酵母发酵能力的影响，结果发现，酵母种类、麦汁浓度大小等因素会影响锌离子对酵母的发酵能力，提升高浓度麦汁中的锌离子含量对于提高酒精含量和酵母的发酵速率起到正面影响。

此外，高浓度发酵比常规发酵产生更多的泡沫，会造成发酵罐的容积率下降，导致不必要的泡沫损失。有关研究表示，可以在发酵阶段通过变温控制来处理这一问题，即发酵初期就使用低温发酵直至高泡期，等高泡期过后，再升到正常发酵温度[22]。

5 结语

研究高浓度酿造对酵母的生理状态、发酵性能及胞内代谢情况产生的影响，可为确保选育优良的高浓酿造菌株提供根本的理论依据。酵母菌株的选育、麦芽汁的制备和发酵过程的控制是影响高浓度啤酒酿造的重要因素，引起了国内外研究者的广泛关注。但在实际生产中，还会受到原料的选择、糖化温度与时间的确定以及代谢副产物等的影响，因此还需要对高浓度啤酒酿造的影响因素进一步研究，以期生产更高品质的啤酒。