干酪苦味肽的形成及脱苦方法研究进展

司阔林，李志国，李玲玉，任敏，赵中华，宗学醒

内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）

干酪（Cheese）种类繁多，可达2 000种以上，且营养物质丰富。干酪是一种主要以牛乳作为原料，通过天然菌株进行自然发酵成熟或者人为添加发酵剂而制成的食品，整个过程需凝乳排出乳清[1]。成熟期是形成干酪特有的色泽、风味、质地和组织状态的过程，其中的蛋白质降解被视为最重要的生化反应。成熟过程中蛋白质（基本为酪蛋白）在凝块中残留的凝乳酶、乳自身含有的蛋白酶和发酵剂及非发酵剂的蛋白酶系统协同作用下，分解生成小分子肽和游离氨基酸（图1）[2]，但是蛋白质降解过度或在水解不利的情况下会产生苦味肽，反而影响干酪的风味，如Cheddar干酪、Gouda干酪、Camembert干酪和Cream干酪等常见的干酪[3-4]。因此，研究干酪成熟过程中蛋白质的降解有利于控制干酪的质量[5]。研究就干酪苦味肽形成机理、苦味肽和苦味的关系和影响因素、特点及脱苦方法进行综述。

1 干酪苦味的形成及影响因素

1.1 苦味肽形成机理

成熟期前的新鲜干酪是没有苦味的，且公认苦味是蛋白质水解不当引起的。但是早期有人认为苦味是蛋白质水解过程中游离氨基酸的增加引起的，直到1952年，Murray等[6]通过研究表明干酪苦味是由蛋白质降解为肽而产生的，随后更多研究者普遍证实了这一观点。如图1所示，蛋白质在干酪成熟过程中首先被凝乳酶等降解为大分子多肽，进而被细菌蛋白酶和肽酶降解生成小分子肽和游离氨基酸。在此过程中，酪蛋白的降解程度不断增加以及降解过程中大部分源于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的中间产物没有被充分进一步降解时，苦味肽就会产生（图2）[7]。而当积累的苦味肽浓度超过一定阈值后，干酪就将产生苦味。

1.2 影响干酪中苦味肽形成及苦味程度的因素

1.2.1 影响苦味肽形成的因素

由图1和图2可知，干酪成熟过程中不管是蛋白质降解还是苦味肽的形成都与蛋白酶紧密有关，相关的蛋白酶系统主要有（图3）[8]：（1）凝结剂（例如凝乳酶、胃蛋白酶、微生物或植物酸性蛋白酶）；（2）牛奶（纤溶酶，可能还有组织蛋白酶D和其他体细胞蛋白酶）；（3）来自发酵剂的酶；（4）非发酵剂或继代培养物（例如P.camemberti，P.roqueforti，Propionibacterium sp.，B.linens和其他棒状杆菌）的蛋白酶-肽酶系统；（5）用于促进成熟的外源蛋白酶或肽酶。而干酪成熟条件如盐浓度、pH、成熟温度和水分含量等通过影响酶活性和微生物的生长繁殖也会间接影响到苦味肽的形成。

图1 干酪成熟过程中的蛋白质降解途径

图2 干酪中苦味肽形成的蛋白质反应图

图3 干酪中乳酸菌蛋白水解酶系统示意图

1.2.1.1 凝乳酶

凝乳酶主要作用于αs1-酪蛋白和β-酪蛋白而产生苦味肽，其中αs1-酪蛋白富含脯氨酸，是由199个氨基酸残基构成的单链磷酸化蛋白质，最易被凝乳酶降解为苦味肽；β-酪蛋白亮氨酸192-酪氨酸193被凝乳酶降解后释放的苦味肽β-酪蛋白（f193-209）也会引起Gouda等干酪的苦味[9]。此外，干酪中苦味肽的含量也和凝乳酶的类型、添加量和残留量有关。王玲[10]对木瓜蛋白酶、微生物凝乳酶和小牛皱胃酶制作的牦牛乳硬质干酪苦味进行比较，结果表明木瓜蛋白酶干酪在Pre-αs-酪蛋白区域有较强的蛋白带，且αs-酪蛋白和β-酪蛋白降解程度以及苦味均显著高于微生物凝乳酶和小牛皱胃酶干酪。刘忠成等[11]研究表明Quark干酪的苦味与凝乳酶添加量和成熟时间呈显著正相关。

1.2.1.2 发酵剂乳酸菌

发酵剂乳酸菌在整个干酪成熟过程中起着至关重要的作用，其中的发酵剂蛋白酶主要通过降解β-酪蛋白而产生苦味肽[12]。并且不同类型的发酵剂乳酸菌制作的干酪所产生的苦味肽含量和苦味程度也有所差异。刘瑛等[13]分别使用3种不同发酵剂制作牦牛乳硬质干酪，研究了干酪形成后6个月成熟期内蛋白质降解和苦味形成的关系，结果表明蛋白质降解与干酪苦味呈正相关关系，嗜热发酵剂成熟的干酪中蛋白质降解程度最大，3～6个月成熟过程中疏水性肽大量增加且苦味最强。因此，有些研究者会选择合适的脱苦发酵剂制作干酪，尽可能地避免产生苦味。

1.2.1.3 成熟条件

在低盐干酪中，苦味肽更易产生，食用盐不仅可以在口感上掩盖苦味，还可以抑制β-酪蛋白水解，从而减少苦味肽相关物质的产生[14]。成熟温度和时间可以显著影响蛋白质降解程度。宋雪梅[15]研究表明5，10和15 ℃成熟牦牛乳硬质干酪中的苦味肽在相同浓度时，15 ℃成熟干酪中疏水性氨基酸含量最高且苦味肽的苦味最为明显。王玲[10]研究表明干酪在成熟3个月后苦味差异开始显著，4个月后苦味已经不能被接受。

1.2.2 苦味和苦味肽之间的关系

干酪的苦味程度取决于苦味肽形成和分解的速度[16]，且苦味主要是由苦味肽中的疏水性氨基酸引起的，特别是长链的芳香族氨基酸残基所致。影响苦味肽苦味强度的因素主要有4点：1）与疏水性氨基酸含量有关。Ney[17]在1971年提出了Q规则——Q=ΣΔf/n（其中Q为多肽平均疏水性值，Δf为氨基酸的自由能改变量，n为短肽中氨基酸数目），表明肽的苦味主要与其疏水度有关，而不是其特殊的氨基酸。但是Q规则只能定性地判断短肽苦与不苦，不能确定其苦味强弱。2）与多肽氨基酸序列有关。苦味肽C-和N-末端一般均为疏水性氨基酸残基，但是残基种类有所不同，C-末端主要为色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸残基，而N-末端则主要为精氨酸、赖氨酸、组氨酸残基，当这些残基距离多肽链很近时就会形成一个特殊的回转结构，从而导致较强的苦味出现。多肽中的回转结构对于苦味的形成很重要，而脯氨酸则是维持回旋结构的重要氨基酸，所以当脯氨酸较多时，多肽的苦味就较强烈。3）多肽苦味的强弱程度还取决于多肽相对分子质量的大小和其肽链长度。使用Q规则可以定性判断分子质量小于6 000 Da的多肽是否具有苦味。4）一般来说，多肽苦味还与一些亲水性基团及氨基酸残基的存在与否有关。

综上所述，多肽的苦味受多种因素影响，其中多肽的氨基酸组成和结构对其苦味的影响较大。

2 苦味肽的分离纯化方法及组成特点

2.1 苦味肽分离纯化方法

在进行苦味多肽的研究时，往往需要将其从原料中提取出来，也就是分离纯化。由于多肽提取受各种因素的制约，在实际操作中有一定难度，而为了获得较多高纯度的多肽，则不能依靠单一的方法，需要将多种分离、纯化方法联合起来进行操作。目前用于分离苦味肽的方法主要为萃取法：溶剂萃取和有机溶剂萃取，最为常见的分别是Harwalkar等[18]的氯仿-甲醇法和Edwards等[19]的乙醇沉淀法。纯化方法主要为凝胶色谱法、膜分离法和反相高效液相色谱（RP-HPLC）法等。1）凝胶色谱法。因为使用此法可以将活性肽快速分离并保证其活性，且操作比较简单、回收率高，所以常被用来分离纯化活性肽及一些其它活性分子。宋雪梅等[20]利用Sephadex G-25葡聚糖凝胶将牦牛乳硬质干酪苦味肽分离成3个不同相对分子质量的组分。2）膜超滤法。这种方法因为只能根据相对分子质量大小进行分离，所以更适合粗多肽的提取，如果想获得高纯度的多肽，还需要结合其他方法进行。分离原理就是比较相对分子质量和膜孔径的大小，根据截流完成分离目的。3）RP-HPLC法。目前苦味肽分离纯化中最常用的方法，具有快速、高效和高灵敏度的特点，疏水性相对较强的分子与固定相之间的相互作用较强而不易洗脱，而疏水性较弱的分子会先流出。Topcu等[21]利用超滤、凝胶色谱和RP-HPLC分别从Turkish白干酪和Kasar干酪分离纯化并鉴定了不同片段的苦味肽。

2.2 苦味肽的组成特点

在分离纯化出干酪中的苦味肽后，国内外不同学者对苦味肽的分子质量、氨基酸组成和通过人工合成苦味肽等方面研究了其组成特点。研究表明不同类型干酪的苦味肽的大小是有所差异的，比如Cheddar干酪中苦味肽的分子质量为190 Da[22]，而Camembert干酪的苦味是由400～3 000 Da大小的肽引起的[23]。宋雪梅等[20]通过分离鉴定牦牛乳硬质干酪苦味肽后发现，组分Ⅱ中有14种苦味肽，其中800～1 500 Da的苦味肽占64.29%，且含有大量的几乎来自β-酪蛋白降解物的疏水性氨基酸尤其是Pro，这也与之前的研究结果基本一致[24-25]。此外，Otagiri等[26]通过合成多种含有不同氨基酸残基（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）的苦味肽类，分析不同肽类中氨基酸残基的排列顺序对苦味的影响，结果表明碱性氨基酸残基精氨酸对苦味有影响。总而言之，干酪中苦味肽的分子质量范围在100～6 000 Da之间，而且疏水性氨基酸对于干酪中苦味肽呈现苦味是必要的。

3 干酪脱苦方法

尽管苦味是蛋白质水解的必然结果，但仍然可以通过掩盖、去除或预防来减轻苦味。因为干酪中的酪蛋白具有其独特的流变特性，使得很多脱苦方法不适用于干酪生产中。而且在干酪的实际生产过程中，还会有很多复杂的变化，所以需要对3个关键步骤进行把控，首先最关键的步骤就是选择水解酪蛋白的蛋白酶，其次是在此基础上严格把控水解过程中的各种参数，最后是根据干酪特有的性质选择合适的方法，最终达到脱苦的目的。脱苦方法的选择对于干酪最终的口感和性状至关重要，目前已经有多种方法被用于干酪生产中，主要包括选择性分离法、包埋掩盖法和生物脱苦法等，其中生物脱苦法由于具有多种优势而被广泛研究应用，在干酪生产中具有广阔的应用前景。

3.1 选择性分离法

选择性分离法是一种可以有效控制干酪苦味的方法。苦味肽由于特有的高疏水性，使其对于活性炭等吸附类物质具有很强的吸附力，利用这一原理就能有效去除苦味肽，但是同时也会去除其中的必需氨基酸，从而造成一些营养物质如蛋白质的损失。如0.5 g/g活性炭吸附疏水氨基酸后，会造成26%±2%蛋白氮的丢失，这主要是由于活性炭对色氨酸和苯丙氨酸或含有色氨酸和苯丙氨酸的多肽的选择性吸附；此外用有机溶剂异丁醇萃取虽然基本脱苦，但是也损失5%～10%的蛋白水解产物[27]。由于经济限制或毒理学考虑，目前还没有去除苦味肽的商业方法。

3.2 包埋掩盖法

通过一些能构成包埋结构的掩盖剂能掩盖苦味，是一种常用的传统脱苦方法[27]：1）环糊精，具有包裹苦味氨基酸疏水功能的能力。但是需要大量的α-环糊精溶液才能基本上掩盖合成肽的苦味，不仅增加了生产成本还影响了产品的口感和质地，同时也会导致部分蛋白氮的损失；2）变性淀粉，利用其“网状结构”覆盖苦味化合物，并阻止它们到达苦味感受器部位。然而，为了达到这个目的，需要将淀粉和苦味肽的混合物加热到100 ℃过夜；3）聚磷酸盐，可以有效地掩盖酪蛋白水解物的苦味，但是价格昂贵，不适合工业化生产；4）酸性氨基酸，苦味可以被天冬氨酸或谷氨酸掩盖，但也会给产品带来一定的酸味。大量的牛磺酸溶液与其他酸性氨基酸一样地有效地降低氨基酸的苦味并且没有酸味，同样也不适用于工业化。

3.3 生物脱苦法

生物脱苦法主要包括酶法和脱苦发酵剂法。

3.3.1 酶法

酪蛋白是一种重要的蛋白质，其在干酪形成过程中有至关重要的作用，因为其富含脯氨酸而脯氨酸水解过程中不易被外切酶水解，所以一般在酪蛋白中对脯氨酸起水解作用的是一些脯氨酸特异性肽酶，这类肽酶使得干酪加速成熟而减少苦味口感。还有一些外切酶也对水解过程及减弱苦味起重要作用，主要包括氨肽酶和羧肽酶。并且这类外切酶从肽链的不同氨基末端开始水解氨基酸，氨肽酶从氨基末端开始水解，而羧肽酶从羧基末端开始水解，随着此过程的进行，疏水性氨基酸从肽链中游离出来，使得苦味减弱。如今已从不同的乳酸菌中分离纯化到这种外肽酶，比如从L.caseisubsp casei LGG中分离纯化得到两种肽酶，分别是脯氨酸氨肽酶和X-脯氨酰二肽基肽酶。这类酶已被证实具有特异性水解脯氨酸的能力，之后又针对胰蛋白酶降解的β-酪蛋白进行了研究，结果表明这两种肽酶可以将β-酪蛋白中的苦味肽进行有效去除[28]。Umetsu等[29]通过小麦羧肽酶从苦味肽的羧基末端释放Δf值大于6 697 J·mol-1的疏水性氨基酸，从而将水解产物当中的苦味物质去除并使得最终消化液中肽类的平均疏水性下降。Bouchier等[30]从L.lactisssp. cremoris AM2中分离纯化得到脯氨酸氨肽酶，并证实此酶可以有效地对β-酪蛋白中的苦味肽进行脱苦。因此可以在干酪生产过程中添加外肽酶以脱苦，但是由于此类酶会产生大量的游离氨基酸（主要是疏水性的），可能会影响蛋白水解物的食品质量，因此使用这些外肽酶的脱苦法也有一定的局限性。

3.3.2 脱苦发酵剂法

国内外已有很多研究证实，许多微生物因为其独特的肽酶体系，因此可以水解一些产生苦味的肽类物质，从而使得产品中苦味减弱或消失。并且这类微生物具有多种优点，如分布广、种类多、生长快和繁殖旺等，而且其代谢产物可以大量积累，这就为获取此类肽酶提供了基础，较来源于动植物的端肽酶更容易被分离纯化。宋兰兰等[31]为了达到降低低盐干酪苦味的目的，以原料乳和Cheddar干酪为对象进行菌株筛选，共筛选获得21株乳杆菌，又分别对产酸能力、水解能力和环境适应性等进行研究，最终获得3株（C5、C8和C9）适用于低盐干酪生产的菌株。Minagawa等[32]利用Thermus aquaticusYT-1的热稳定和金属依赖性氨基肽酶T特异性的特性，有效地减少甚至消除用3种蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）获得的酪蛋白水解产物中存在的肽组分的苦味。Shimamura等[33]利用9种乳酸菌发酵剂中的无细胞提取物（CFE）降解来自酪蛋白的苦味肽，其中4株菌株的降解活性超过90%，之后又选择L.lactisssp. lactis 527的亚细胞部分进行试验，结果表明细胞质和细胞膜部分对苦味肽有较高降解活性。屈倩[34]在制作低盐Cheddar干酪之前，选择了5株乳酸菌菌株测试其对苦味肽的降解活性，结果表明5株菌株的CFE均可以降解苦味肽，降解活性在19.60%～73.82%之间，而且降解活性很大程度上与乳酸菌类型相关，其中菌株M5对于苦味肽的降解活性高达73.82%。因此，筛选具有降解苦味肽能力的发酵剂成为干酪脱苦的一个重要方向。

3.4 其他脱苦法

除了以上几种常见的干酪脱苦法，还有其他一些不常用的脱苦法，如类蛋白法[35]，在适当的条件下，将部分水解的蛋白质（如酪蛋白）与某种蛋白水解酶一起培养会形成“类蛋白”（一种类似蛋白质的高分子物质，其性质与原始蛋白质完全不同，这种类蛋白反应在获得无苦、温和的蛋白质类食品原料方面非常有效，但缺点是产量低和可逆性产生苦味）。此外，也可以通过改进干酪加工工艺进行脱苦，如在微氨化环境中制作干酪后的3～10 d，将表面模制的软奶酪（Camembert干酪）培养在外层中使pH快速升高，干酪青霉生长较慢，蛋白水解较弱，苦味降低，缺点同样是条件苛刻，不适合工业化生成[27]。

4 结语

干酪具有很高的营养价值，越来越受到消费者的喜爱，消费范围也在逐年扩大。干酪的种类繁多，成熟过程是一个极其复杂的生化反应过程，其中蛋白质降解是干酪日常生产中最为复杂的反应之一，而且蛋白质降解对干酪的成熟及成品干酪的质地与口感具有重要影响。酪蛋白的水解对于干酪成品的品质具有重要意义，如果水解不当，就容易产生苦味物质，这不仅会影响干酪口感，还会降低其营养价值，对于生产销售而言都是重大的打击。因此，通过对干酪苦味肽的形成机理、影响因素及组成特点进行深入的研究，在此基础探讨有效去除干酪苦味的方法，可为提高干酪产品的质量及指导实际生产过程提供理论参考。