QuEChERS EMR-Lipid结合LC/MS/MS测定水产品中15种喹诺酮类抗生素

张颖 ，陈璐，赵巧灵*，汤海凤，吴益春，陈静

1. 浙江海洋大学食品与医药学院（舟山 316022）；2. 舟山市食品药品检验检测研究院（舟山 316013）

水产养殖业是我国渔业中不可或缺的组成部分，其中大黄鱼是中国九大海水鱼之一。根据《中国渔业统计年鉴》数据显示[1]，2018年中国海水鱼类养殖产量149.5万 t，其中大黄鱼养殖量最大，达到19.80万 t。但是随着水产养殖产业快速发展，也存在关键养殖技术欠缺、育苗成活率偏低、产品质量安全存在隐患等突出问题。众所周知，2006年“多宝鱼事件”，在养殖大菱鲆中检出违禁药物，使得海水养殖产业遭到沉重打击。因此，在海水养殖环节中，渔药过量使用或禁用渔药违法添加引起的药物残留问题构成危害水产品质量安全的主要问题。

喹诺酮类药物[3-4]属于广谱抗生素，可有效预防和治疗多种传染病，在水产养殖领域中被广泛应用，在GB 31650—2019中规定鱼中恩诺沙星等抗生素药物最大残留限量100 μg/kg。近年来，喹诺酮类检测的相关文献中，净化除脂的主要方法有固-液萃取法[5-6]、固相萃取法[7-9]、QuEChERS[10-11]等，其中冷冻除脂和固相萃取法耗时过程较长，QuEChERS法具有快速、准确、灵敏、高效等特点而被广泛应用于兽药残留的检测。Enhanced Matix Removal Lipid（EMRLipid）[12-15]，是一种根据油脂类（如游离脂肪酸、磷脂、甘油三酯等）结构特点有效去除脂质的新型QuEChERS净化剂，其能减少脂质基质对兽药的吸附干扰。该技术尚未见用于养殖水产品中喹诺酮类兽药检测的报道。试验以水产养殖中最常用抗生素喹诺酮类药物作为研究对象，以大黄鱼为代表作为研究基质，基于QuEChERS EMR-Lipid结合液质联用技术，建立养殖水产品中15种兽药残留的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

G4220B/G6470A三重四极杆液相色谱质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；Multi Reax多管式旋涡混合器（德国Heidolph公司）；AVANTIJ-E高速离心器（BECKMAN COULTER公司）；N-EVAPTM-111氮吹浓缩仪（美国欧加农公司）；KQ-600DV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QGARD00R1超纯水机（法国Millipore）。

15种喹诺酮类抗生素（见表1）标准品的纯度均大于94.0%，购自上海安谱科学仪器有限公司；乙腈、甲醇（德国默克股份良合公司）；甲酸（上海安谱科学仪器有限公司）；增强去脂萃取盐包（m（无水MgSO4）∶m（NaCl）=4∶1）；增强型去脂分散净化管（EMR-Lipid dSPE管，1 g，15 mL）。

标准储备液：精确称取15种喹诺酮类标准品，以乙腈作为定溶液，配制标准混合液100 μg/mL，冷冻贮藏（-18 ℃）。使用时，以含0.1%甲酸的10%乙腈溶液作为定溶液，梯度稀释成5个浓度点的标准液。

1.2 样品前处理

称取2 g（精确至0.01 g）均质后的大黄鱼样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入陶瓷均质子（2粒），先加入2 mL 1%甲酸水溶液后涡旋2 min，再加入8 mL 1%甲酸乙腈溶液，接着加入增强去脂萃取盐包，快速涡旋振荡2 min分散均匀，超声15 min，以3 000 r/min离心5 min；取上层液转移到QuEChERS EMR-Lipid dSPE管中，快速涡旋2 min，以5 000 r/min离心5 min；取上清液到15 mL离心管中，于50 ℃水浴氮吹至干。加1 mL 10%乙腈溶液（含0.1%甲酸）进行复溶，超声溶解后过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.3 色谱-质谱条件

色谱柱采用Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A采用0.2%甲酸水溶液，流动相B采用0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～0.5 min，2% B；0.5～1.8 min，2%～15% B；1.8～6.0 min，15%～25% B；6.0～6.5 min，25%～20% B；6.5～7.0 min，20%～30% B；7.0～11.0 min，30%～35% B；11.0～16.0min，35%～100% B；6.0～20.0 min，100% B。流速0.5 mL/min；进样量5.0 μL。

质谱条件：气体温度350 ℃；气体流量5 L/min；雾化器压力45 psi；鞘气温度350 ℃；毛细管电压正4 500 V，负3 500 V；喷嘴电压正500 V，负500 V。电喷雾电离正模式（ESI+）；检测模式采用MRM模式。15种化合物的监测离子对（m/z）、丰度比、去簇电压、碰撞能等参数见表1。

表1 15种喹诺酮抗生素的质谱条件

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

为获得15种喹诺酮类抗生素的质谱最优参数，选择正离子模式下进行一级质谱扫描，获得精准母离子（m/z），优化15种化合物的毛细管电压和去簇电压参数；为获得15种化合物的2个或以上的子离子（m/z），进行全扫描，以二级质谱获得最高丰度和第二高丰度的碎片离子分别作为定量离子和定性离子，并优化15种化合物的碰撞电压，使得每种化合物离子对强度达到最大，15种抗生素优化的质谱参数见表1。

2.2 流动相优化

比较4种不同流动相（甲醇-水溶液，乙腈-水溶液，乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液和0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液）对15种化合物的响应、峰形和分离效果的影响。结果表明，依诺沙星在甲醇-水溶液中不能被有效分离，添加乙酸铵的流动相依诺沙星响应较低，流动相中加0.2%甲酸可显著提高15种化合物的丰度值。因此，选用0.2%乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相，15种喹诺酮类抗生素（1 μg/mL）的选择性离子流图见图1。

图1 15种喹诺酮类抗生素（1 μg/mL）的选择性离子流图

2.3 提取溶剂优化

查阅相关文献报道，喹诺酮类抗生素分析中多采用乙腈作为提取溶剂。大黄鱼是高蛋白高脂肪的水产鱼种，乙腈对高脂肪高蛋白的基质可达到有效提取目标化合物的目的；同时考察在提取溶剂中加入适量甲酸提高抗生素的提取效率。比较3种提取溶剂，分别为乙腈、1%甲酸乙腈溶液和1%甲酸乙腈水溶液（V（乙腈）∶V（水）=4∶1），对抗生素药物的回收率影响。由结果可知，1%甲酸乙腈水溶液提取效果最优，15种喹诺酮抗生素回收率在83.5%～106.4%。因此，选用1%甲酸乙腈水溶液作为提取溶液。

2.4 线性关系与检出限

在1～200 ng/mL线性范围内进行标准曲线检测，从表2中可知，15种喹诺酮类抗生素在相对应浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）＞0.998（除依诺沙星之外）。以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限（LOD），15种喹诺酮类抗生素的LOD为0.5～2.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率与精密度

选取空白大黄鱼样品分别进行3个水平的加标回收和精密度试验（n=6）。由表2可知，在加标浓度范围内，15种目标物的平均回收率为75.8%～112.3%，δRSD为2.3%～10.2%。方法的准确度和重复性均满足定量分析的要求。

2.6 实际样品测定

采用试验建立方法对购买于市场上6种养殖水产样品，包括大黄鱼、鲫鱼、鳊鱼、大菱鲆、黄颡鱼、黑鱼，进行测定。经检测发现，恩诺沙星、氧氟沙星在大黄鱼、大菱鲆中均有检出，恩诺沙星检出含量在20～80 μg/kg，氧氟沙星检出含量在10～50 μg/kg，结果表明所建立的方法能满足日常检测需求。

表2 15种待测物的线性方程、相关系数、方法检出限、回收率和精密度

3 结论

基于QuEChERS EMR-Lipid净化技术结合UPLCMS/MS技术用于水产品中15种喹诺酮类抗生素的快速检测，采用1%甲酸乙腈水溶液作为提取溶液，经过EMR-Lipid的高效去脂净化过程，有效提高方法的灵敏度和准确度，成功应用养殖水产样品中15种喹诺酮类抗生素的检测，具有较好的适用性和应用性。