固相萃取-超高效液相色谱法测定橄榄油中角鲨烯含量

李文，王伟 ，关荣发*，张玉，李雪，沈国新

1. 中国计量大学生命科学学院（杭州 310016）；2. 浙江省农业科学院（杭州 310016）；3. 木本油料品质营养国际联合实验室（杭州 310016）

角鲨烯（Squalene）又名鲨烯、鲨萜、角鲨油素、鱼肝油萜，是一种高度不饱和的开链三萜类化合物，属脂质不皂化物。角鲨烯具有促进心血管健康[1]、防癌抗癌[2]、抗抑郁[3]、解毒[4]、免疫[5]以及用于药物缓释[6]等方面的健康功效，但相关系统性的临床研究还较为有限。角鲨烯主要来源于深海鲨鱼肝油，植物性产品橄榄油中的角鲨烯含量较高，除了橄榄油[7]之外，其他植物油如南瓜籽油[8]、油茶籽油[9]、苋菜种子油[10]、香薷籽油[11]、灵芝孢子油[12]也或多或少含有角鲨烯。伴随着角鲨烯在不同生物质中的发现，国内外学者对角鲨烯的含量和生物活性的研究也相继展开。

橄榄油中角鲨烯的分析测定主要包括样品前处理与定量定性分析。样品前处理方法有传统提取和新型提取两类。其中有机溶剂提取法[13]、皂化法[14]为传统提取方法，固相萃取法[15]、固相微萃取法[16]和超临界CO2萃取法[17]为新型前处理方法。关于角鲨烯的检测技术，有气相色谱（Gas chromatography，GC）法[18]、高效液相色谱（Performance liquid chromatography，HPLC）法[19]、超高效液相色谱（Ultra high performance liquid chromatography，UPLC）法[20]、气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）法[21]等。但这些方法或是将油脂甲酯化[22]，直接测定甲酯化后的产物；或是将油脂皂化衍生化后进行气相色谱分析，操作温度较高，测定过程可能会破坏样品分子结构；或是需要超临界流体辅助，操作步骤繁琐、前处理时间长、试剂用量大，不能达到角鲨烯快速检测的要求。超高效液相色谱具有普通高效液相色谱所不具有的超高的分离度、速度和灵敏度，能够与不同的检测器联用从而对不同物质中的角鲨烯进行分析，与气相色谱相比又无需高纯气体辅助、无需衍生化处理、无需较高温度，操作更简便。固相萃取消除了极性化合物、色素等的干扰，净化了样品，同时保护了超高效液相色谱系统。此次试验采用固相萃取结合超高效液相色谱检测技术，比较9种固相萃取小柱提取、净化、富集橄榄油中的角鲨烯，进行橄榄油中角鲨烯简便、准确、快速的检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

橄榄油（实验室购买）；角鲨烯标准对照品（纯度＞98.0%，东京化成工业株式会社），购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；甲醇、乙腈（色谱级），默克股份有限公司；正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮（分析级）、甲酸（色谱级），均购自上海凌峰化学试剂有限公司；固相萃取净化柱：Diol净化柱（1 g/6 mL）、Florisil PR净化柱（1 g/6 mL）、Silica净化柱（1 g/6 mL）、Alumina-N净化柱（1 g/6 mL）、NH2净化柱（1 g/6 mL）、CN净化柱（1 g/6 mL）、Carb净化柱（1 g/6 mL）、PSA净化柱（1 g/6 mL）、PA净化柱（1 g/6 mL），购自上海Welchrom公司；0.22 μm有机微孔滤膜；电子分析天平，精度为0.1 mg；Anke TDL-5-A型台式离心机，转速≥3 000r/min；TM-2 Wiggens涡旋振荡器，转速≥2 000 r/min，德国维根斯；Supelco固相萃取仪；TTL-DCI型氮吹仪；Uplc I-class型超高效液相色谱仪配紫外（Ultraviolet，UV）检测器，美国Waters公司；超纯水（18.2 MΩ·cm），由青岛富勒姆科技有限公司超纯水器制。

1.2 橄榄油样品前处理

准确称取0.12 g（精确至0.001 g）橄榄油样品于10 mL离心管中，加入0.6 mL正己烷，涡旋混合均匀，待净化。上样前，首先用10 mL正己烷对固相硅胶萃取净化柱进行预淋洗；然后将待净化橄榄油样品上样至固相硅胶萃取净化小柱上，以1滴/s的速度通过已活化过的固相萃取柱；再用10 mL正己烷分2次润洗离心管，然后转移至固相硅胶萃取净化小柱上，以1滴/s的速率洗脱角鲨烯，收集上样流出液和洗脱液，在室温下氮气吹干，残余物用2 mL甲醇复溶，过0.22 μm有机微孔滤膜转移至进样小瓶，待超高效液相色谱紫外检测器（Ultra high performance liquid chromatography-平共处Ultraviolet，UPLC-UV）检测。

1.3 色谱分析条件

色谱柱Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相为100%乙腈，等度洗脱，流速为0.20 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为2 μL；紫外检测器检测波长为210 nm。

1.4 标准溶液配制

角鲨烯标准储备液（1 600 μg/mL）的制备：准确称取0.080 0 g（精确至0.000 1 g）角鲨烯标准品，加适量甲醇，振摇，使角鲨烯溶解后，再加甲醇定容至50 mL容量瓶中，充分振荡溶解，过滤，储存在棕色瓶中4 ℃以下保存备用。使用时可根据需要稀释成不同浓度，现用现配。

角鲨烯标准工作液的制备：精密量取适量角鲨烯对照品储备液，加甲醇逐级稀释成9，90，360，720和1 200 μg/mL的梯度角鲨烯系列标准溶液。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 固相萃取净化柱的选择

要将橄榄油中角鲨烯进行很好的分离净化，固相萃取柱填料的选择是试验的核心。由于角鲨烯极性较小，利用不同类型固相萃取小柱对角鲨烯的保留强度不同，此次试验比较了Diol、FL、SI、AL-N、NH2、CN、Carb、PSA、PA 9种类型的固相萃取柱对待分析物角鲨烯富集的影响。按1.2方法进行处理，最后采用UPLC-UV分析检测角鲨烯含量。

结果表明，9种类型净化柱处理得到的角鲨烯均得到了良好分离，9种固相萃取小柱净化角鲨烯的色谱图如图1所示。其中经SI、PSA、Diol、FL固相柱处理得到的橄榄油样品，杂峰较少。净化效果最好的为SI净化柱，其次为FL、Diol、PSA。选择正己烷作为固相萃取柱活化洗脱剂，Diol净化柱、AL-N净化柱、NH2净化柱、CN净化柱、Carb净化柱、PSA净化柱、PA净化柱、FL净化柱作为角鲨烯分离纯化固相萃取小柱时，部分油脂也被洗脱下来，其中经Carb净化柱、PSA净化柱处理的橄榄油样品，被洗脱下来的油脂为无色透明油脂，以上8种均未达到油脂与目标物角鲨烯良好分离的目标。

SI净化柱对橄榄油样品进行前处理的结果表明，极性吸附剂硅胶将甘油三酯成分很好地保留在吸附剂上，而首先将待分析物角鲨烯洗脱下来，未发现油脂被洗脱下来，净化效果良好。在1.3色谱分析条件下对同一橄榄油样品进行检测，经硅胶柱处理得到的角鲨烯回收率最高。经9种固相萃取小柱净化处理检测到的角鲨烯回收率如图2所示。因此，选择硅胶净化柱进行橄榄油中角鲨烯的分离纯化。

2.1.2 洗脱溶剂的选择

选择SI硅胶净化柱，在同样洗脱体积下，考察洗脱剂A（正己烷）、洗脱剂B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脱剂C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脱剂D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脱剂E（丙酮）5种不同洗脱溶剂对角鲨烯纯化的影响。结果表明：在5种不同洗脱溶剂处理下的UPLC-UV图谱中，角鲨烯均分离良好且峰型尖锐，但经过洗脱剂B（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=9∶1）、洗脱剂C（V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=8∶2）、洗脱剂D（V（正己烷）∶V（三氯甲烷）=5∶1）、洗脱剂E（丙酮）洗脱，SI硅胶净化柱的色谱图中杂峰较多，回收率低，因此选用洗脱剂A（正己烷）进行角鲨烯洗脱，其效果最佳，结果见图3。

图1 9种固相萃取柱净化处理角鲨烯色谱图比较

图2 9种固相萃取柱净化处理检测到的角鲨烯回收率

图3 不同洗脱剂对角鲨烯回收率的影响

2.1.3 洗脱体积的选择

以正己烷溶剂为洗脱剂，试验比较了不同的洗脱体积对角鲨烯回收率的影响，洗脱曲线见图4。结果表明：当洗脱溶剂正己烷体积＜10 mL时，角鲨烯回收率随洗脱体积的增大而增大；当洗脱体积≥10 mL时，角鲨烯回收率趋于平稳。故采用10 mL正己烷作为洗脱剂。

图4 不同洗脱体积对角鲨烯回收率的影响

2.2 UPLC分析条件的确定

在UPLC分析中，色谱的分离和数据的采集是同时进行的。为了使角鲨烯组分达到较好分离，必须选择合适的色谱分析条件，例如流动相、流速、柱温、色谱柱类型。

2.2.1 流动相的选择

在流速0.20 mL/min、柱温30 ℃、紫外检测波长210 nm、进样量2 μL的相同条件下，改变流动相，考察甲醇[23]、甲醇-水、乙腈、乙腈-水[24]、甲醇-甲酸水[25]体系对分离效果的影响。

在甲醇100%、甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水体系、乙腈100%、乙腈-水等流动相下，UPLC-UV色谱图表明，经9种类型的固相萃取净化柱处理的橄榄油样品中目标物角鲨烯均与其他杂峰分离良好。在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水体系中，随着有机相比例的增加，保留时间逐渐缩短。在甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水体系中，相同流动相配比下，乙腈-水体系下的角鲨烯保留时间最长。甲醇-水和甲醇-0.2%甲酸水体系下分离效果基本相同，而柱压较低的乙腈-水流动相系统，更有助于保护UPLC色谱系统，故选择乙腈-水流动相体系，考虑到柱子的使用寿命和样品保留时间，选择纯乙腈为流动相。

2.2.2 流速的选择

以纯乙腈为流动相，色谱柱柱温为30 ℃，紫外检测器检测波长为210 nm，进样量为2 μL，考察不同流动相的流速（0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL/min）对角鲨烯检测的影响。

在0.10～0.30 mL/min流速范围内，流速增大，角鲨烯的保留时间均缩短。当流速为0.10和0.15 mL/min时，角鲨烯出峰时间过长，且当流速为0.1 mL/min时角鲨烯存在拖尾现象。当流速＞0.20 mL/min时，角鲨烯出峰时间大大缩短但缝宽较窄。结合色谱系统压力和角鲨烯保留时间，选择0.20 mL/min作为流动相的流速。

2.2.3 柱温的选择

柱温是重要的色谱操作条件之一，它直接影响色谱柱的选择性、色谱峰区域展宽和分析速度。以纯乙腈为流动相，流速为0.20 mL/min，紫外检测波长为210 nm，进样量为2 μL，考察不同柱温（20，25，30，35和40 ℃）对橄榄油中角鲨烯分离的影响。结果如图5所示。

图5 不同柱温下角鲨烯色谱图

在20～40 ℃柱温范围内，峰形变化很小，样品主峰与其他杂质峰均分离良好，样品的保留时间随着柱温的升高均缩短。因柱温太高易损伤色谱柱，综合考虑样品的保留时间、柱子的使用寿命以及经济性和便利性等因素，柱温选择30 ℃。

2.2.4 色谱柱的选择

由于角鲨烯极性很弱，适合用反相色谱柱，所以试验选用C18的反相柱。考察Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱对分离效果的影响。如图6（a）所示，选择Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱时，目标物角鲨烯分离良好，但角鲨烯峰对称性不好；选用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱时，角鲨烯峰型尖锐，对称性好。综合考虑，选择ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱进行角鲨烯的检测分析。

图6 不同色谱柱下角鲨烯色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线及检出限

用1 600 μg/mL的角鲨烯标准储备溶液，以甲醇为溶剂进一步稀释，配制成质量浓度分别为9，90，360，720和1 200 μg/mL的角鲨烯标准工作液系列。以角鲨烯标准品的质量浓度作为横坐标，角鲨烯的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图7所示。以信噪比S/N=3以及S/N=10对应的质量浓度分别作为检出限（limit of determination，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），结果见表1。

图7 角鲨烯标准曲线

表1 角鲨烯线性范围及定量限

2.3.2 稳定性试验

精确称取0.12 g橄榄油样品，经硅胶柱提取处理后用甲醇定容至2 mL，每隔3 h进样2 μL，按照优化的1.3色谱条件进行定量分析。稳定性试验结果见表2。δRSD为0.049%，说明用该方法制成的供试样品溶液中的角鲨烯在24 h内稳定。

表2 稳定性试验结果

2.3.3 精密度试验

精密度是衡量可靠性的另一个指标。在优化的色谱条件下，连续进样6针角鲨烯标准品，进样精密度试验结果见表3。精密度δRSD为0.440%。

表3 精密度试验结果

2.3.4 回收率试验

加标回收率是表示准确度的一个指标。用已知角鲨烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄榄油样品进行添加回收率试验。准确称取9份0.12 g同一已知角鲨烯含量橄榄油样品，每3份样品为1组，每组分别准确加入高、中、低3个水平的角鲨烯标准品。样品处理和角鲨烯的定量分析按1.2和1.3的优化条件进行。先测定添加样品中的角鲨烯含量，减去已知角鲨烯含量（4 994.18 mg/kg）的橄榄油样品，再计算添加回收率，加标样品的回收率结果见表4。角鲨烯的加标回收率在98.38%～103.109%之间，平均添加回收率为100.836%，相对标准偏差δRSD为2.35%。表明该方法回收率较好，数据准确可靠。

2.3.5 重复性试验

取某一种橄榄油，按照1.2条件进行样品预处理，并在1.3色谱条件下进行检测分析（平行试验，n=6），并计算重复性相对标准偏差δRSD。结果如表5所示，重复性δRSD值为0.046%。结果表明在1.2的处理方法和1.3的色谱条件下，测定方法比较稳定，测定数据重现好。

表4 加标样品的回收率结果

表5 重复性试验结果

2.4 实际样品测定

采用该方法对实验室中来自澳大利亚、突尼斯、希腊、意大利的6种橄榄油进行检测（平行试验，n=3），角鲨烯含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之间，在Salvo等[26]研究的1 448～7 474 mg/kg角鲨烯含量范围之内。由表6可知，在6种橄榄油中，澳大利亚特级初榨橄榄油中角鲨烯含量最高，达5 191.548 mg/kg，其次为编号2和1的意大利贝斯隆橄榄油，其中的角鲨烯含量分别为4 998.564和4 287.582 mg/kg。再次为希腊伊莉雅（4 048.285 mg/kg）和希腊卡利士多（3 577.879 mg/kg），突尼斯亨洛德庄园1#中角鲨烯含量为2 152.262 mg/kg，突尼斯亨洛德庄园2#中角鲨烯含量在所有油中含量是最低的（1 907.364 mg/kg），而同为澳大利亚的澳根尼橄榄油中角鲨烯含量仅2 047.671 mg/kg，说明橄榄油中角鲨烯的含量可能受地域和橄榄油品种的影响。

表6 实际样品的测定

3 结论

橄榄油中角鲨烯含量的固相萃取-超高效液相色谱紫外检测方法，具有操作简便、准确度高、重现性好的特点。此次试验探讨了不同色谱柱、固相萃取净化柱、流动相、流速、柱温对角鲨烯含量的影响，利用优化方法快速定量检测4个不同地区的6个品种的橄榄油中角鲨烯，其含量在1 907.364～5 191.548 mg/kg之间，这可能是由于种植环境和橄榄油品种不同所造成的。