响应面法优化复合酶水解制备牡蛎肽及其分析评价

姚凤丽，张明振，王鹏，刘霞，乔乐克，张京良 *

1.中国海洋大学食品科学与工程学院（青岛 266003）；2.中国海洋大学医药学院（青岛 266003）；3.乳山市华隆生物科技股份有限公司（威海 264513）；4.青岛市市立医院（青岛 266011）；5.青岛海洋生物医药研究院（青岛 266071）

牡蛎（oyster），俗称生蚝，是全球养殖规模最大的贝类品种，也是我国重要的养殖贝类品种之一[1]。牡蛎营养丰富，富含蛋白质、糖原、牛磺酸、维生素以及硒、铁、钙等微量元素[2]。牡蛎蛋白氨基酸组成完全，质量优于牛乳和人乳[3]，素有“海中牛奶”之称。目前，牡蛎的利用仍以鲜食和加工制成干制品为主，市面上的牡蛎精深加工制品较少，这严重限制了牡蛎的高值化利用。牡蛎是开发生物活性肽的优良材料。研究表明，牡蛎肽有抗氧化[4]、增强免疫力[5]、抗肿瘤[6]、抑菌[7]等多种生物活性，而且牡蛎肽鲜味氨基酸含量丰富，可被广泛应用于功能食品和海鲜调味品的研究开发，前景广阔。

酶解法制备牡蛎肽，由于条件温和、专一性强、水解程度高等优点，是目前重点研究和使用的方法，其中复合蛋白酶酶解相较单一酶酶解，往往能获得更高的水解度、更好的外观及口感，已逐步成为近年来的研究热点。

此次试验采用胰酶和木瓜蛋白酶复合酶解制备牡蛎肽，通过单因素试验和响应面法优化酶解条件，并对酶解产物进行分析评价，为牡蛎的精深加工及牡蛎肽的开发利用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡蛎（乳山市华隆生物科技股份有限公司）；胰酶（酶活力35×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力80×104U/g）：广西南宁庞博生物工程有限公司；分子量测定标准品（北京索莱宝科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）；SKD-100凯氏定氮仪（上海沛欧分析仪器有限公司）；PH2700酸度计（美国EUTECH公司）；Agilent 1260液相色谱仪（Agilent公司）；L-8900型氨基酸自动分析仪（日本日立集团）。

1.3 试验方法

1.3.1 牡蛎酶解基本工艺

新鲜牡蛎去壳洗净并捣碎，加蒸馏水调节料液比为1∶1（g/mL），升温至50 ℃，调节pH 7.5，按2 000 U/g加入复合蛋白酶（胰酶与木瓜蛋白酶固定活力比为2∶1）保温酶解2 h后，沸水浴10 min灭酶，冷却至室温，以8 000 r/min离心10 min，取上清，加入1%的活性炭吸附0.5 h，0.22 μm膜过滤，冷冻干燥得牡蛎肽样品。

1.3.2 酶解条件优化

1.3.2.1 单因素试验

在牡蛎酶解基本工艺的基础上，以水解度为指标，分别考察不同加酶量（1 000，2 000，3 000，4 000和5 000 U/g）、料液比（1∶0，1∶0.5，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5（g/mL））、酶解温度（40，45，50，55，60和65 ℃）、酶解pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0）、酶解时间（1，2，3，4，5，6，7和8 h）对牡蛎蛋白水解度的影响。

1.3.2.2 响应面优化

以水解度为响应值，在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken原理进行四因素三水平响应面试验设计。4个因素分别为加酶量（3 000，4 000和5 000 U/g）、酶解温度（40，50和60 ℃）、酶解pH（6.0，7.0和8.0）、酶解时间（3，4和5 h）。

1.3.3 水解度的测定

酶解液总氮含量采用凯氏定氮法[8]测定，氨基酸态氮含量采用中性甲醛滴定法[9]测定。水解度按式（1）计算。

1.3.4 牡蛎肽分子质量测定

参照邹琳[10]的方法，略作修改。采用凝胶渗透色谱（GPC）法测定牡蛎肽分子质量分布。色谱条件：流动相体积比为V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=40∶60∶0.05；使用TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）色谱柱；进样体积10 μL；流速1.00 mL/min；检测波长220 nm。所得数据用GPC软件分析，获得牡蛎肽的分子质量分布。

1.3.5 牡蛎肽氨基酸组成分析

牡蛎肽样品经酸水解后，用全自动氨基酸分析仪检测除色氨酸之外的17种氨基酸[11]，色氨酸采用比色法[9]测定。

1.3.6 牡蛎肽氨基酸营养评价

根据FAO/WHO建议的氨基酸评分标准模式进行氨基酸评分（amino acid score，ASS）[12]，以标准全鸡蛋蛋白质氨基酸含量为基准进行化学评分（chemical score，CS），计算必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）[16]。具体计算方法如式（2）～（4）所示。

式中：n为必需氨基酸数目；a，b，c，…，h为样品中必需氨基酸的含量，mg/g；A，B，C，…，H为标准全鸡蛋蛋白质对应必需氨基酸含量，mg/g。

1.4 数据处理

使用Excel和SPSS 22.0进行数据处理，每组试验设置3个平行，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1（a）可知，在加酶量1 000～5 000 U/g的范围内，水解度随加酶量的增加呈先升高后平缓的趋势。底物充足时，增加酶量可以提高酶与底物的接触率，水解度升高；当加酶量达到4 000 U/g时，继续增加酶量，酶解速率受底物量制约，水解度增加不明显。

由图1（b）可知，料液比较小时底物浓度高，底物堆积影响水解效率[17]；当料液比为1∶2（g/mL）时水解度最高，料液比继续增大，底物浓度降低，影响底物与酶结合效率，水解度降低。

由图1（c）可知，在40～65 ℃的温度范围内，随着温度的升高，水解度呈现先小幅升高后降低的趋势；50 ℃时水解度最大（25.62%），在45～55 ℃温度范围内，水解度维持在较高水平，为复合酶的适宜酶解温度范围；温度继续升高，酶变构失活，水解度急剧降低。

pH影响酶活性中心的构象，从而影响酶和底物的特异性结合，过酸或过碱均会降低酶活。由图1（d）可知，在pH 6.0～9.0的范围内，水解度随pH增加先升高后降低，当pH为7.0时水解度最高，即复合酶的最佳酶解pH为7。

由图1（e）可知，水解度随着酶解时间延长先增加后稳定。随着酶解时间的延长，体系游离氨基酸含量增加，水解度持续上升，在4 h时达到最大；继续延长酶解时间，底物继续消耗，底物与酶的接触率下降，导致水解变慢，水解度增势变缓，因此最佳酶解时间为4 h。

图1 各因素对水解度的影响

2.2 响应面优化结果

2.2.1 试验结果及模型分析

按照Box-Behnken试验设计原理，进行四因素三水平响应面试验，共进行29组试验，试验结果见表1。

表1 响应面试验设计及结果

利用Design-Expert软件进行回归分析，得到的预测模型为Y=+28.26+2.07A-0.82B-1.17C+1.86D-0.49AB+0.29AC-1.13AD-0.98BC-0.23BD+0.040CD-0.44A2-3.49B2-1.97C2-0.55D2。

对上述模型及各项系数进行方差分析，结果见表2。回归模型整体极显著（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.221 3＞0.05），证明试验设计合理，模型拟合度高。R2=0.957 6，说明此回归模型拟合较好；R2Adj=0.915 2，表明该模型可以解释91.52%的响应值变化。该模型中，一次项A、B、C、D，二次项B2、C2对水解度的影响极显著（p＜0.01），交互项AD、BC对水解度的影响显著（p＜0.05），其余各项不显著。

表2 回归模型方差分析与显著性检验

2.2.2 交互作用分析

响应面在水平方向投影形成的等高线形状可以反映交互作用强弱，等高线形状呈椭圆形代表交互作用较强[14]。图2为各因素交互作用的响应面图，可以看出，加酶量（A）和酶解时间（D）、酶解温度（B）和酶解pH（C）交互作用显著，交互作用分析结果与方差分析及显著性检验结果一致。

图2 各因素交互作用的响应面图

2.2.3 最优条件预测及检验

根据上述回归模型预测的最优条件为加酶量4 999.99 U/g，酶解温度48.14 ℃，酶解pH 6.83，酶解时间4.69 h；预测最优条件下水解度为30.34%。为方便试验，将上述条件调整为加酶量5 000 U/g，酶解温度48.1 ℃，酶解pH 6.8，酶解时间4.7 h；在此条件下，实际测得的水解值为30.65%，与预测结果相差较小，证明响应面模型预测准确。

2.3 产物分子质量测定

分子质量＜1 000 Da的肽被称为寡肽或低聚肽，研究表明二肽、三肽等寡肽可以直接被人体吸收[15]，证明寡肽具有更高的营养价值。

由图3可知，该牡蛎肽的重均分子量（MW）为948 Da，99.66%以上的牡蛎肽分子质量在5 000 Da以下，分子质量低于1 000 Da的占65.61%，表明复合酶酶解效果优异，获得的牡蛎肽分子质量较小，具有较高的营养价值和良好的潜在生物活性。姚玉静等[16]利用胰蛋白酶和风味蛋白酶酶解制备牡蛎肽，产物中分子质量＜1 000 Da的多肽占50.1%，分子质量＜3 000 Da的多肽占83.5%，与此次研究结果相近。

图3 牡蛎肽的凝胶渗透色谱图

2.4 氨基酸组成分析及营养评价

2.4.1 氨基酸组成分析

由表3可知，牡蛎肽中共鉴定出18种氨基酸，氨基酸种类齐全，其中8种必需氨基酸占总含量的38.10%，接近FAO的理想模式（40%），必需氨基酸/非必需氨基酸为61.55%，说明该牡蛎肽是一种优质的蛋白来源。牡蛎肽中6种鲜味氨基酸齐全，鲜味氨基酸含量占氨基酸总量的46.5%，其中Glu含量最高，占总氨基酸含量的14.87%，可见该牡蛎肽具有鲜美的风味。

2.4.2 氨基酸质量评价

牡蛎肽的氨基酸评分（ASS）及化学评分（CS）计算结果如表4所示。以ASS为标准时，各氨基酸评分均大于或接近100，评分最高的是Lys，其ASS评分为147.6；以CS为标准时，第一限制性氨基酸为Met+Cys，第二限制性氨基酸为Trp，评分最高的是Lys，其CS评分为123.03。FAO/WHO规定EAAI≥85时，属于优质蛋白源，本研究所得牡蛎肽EAAI为91.68，必需氨基酸含量高且与理想氨基酸组成接近，可以作为优质的营养来源。

表3 牡蛎肽的氨基酸组成

表4 牡蛎肽中必需氨基酸营养评价

3 结论

此次研究优化了复合酶法制备牡蛎肽的工艺，使用胰酶和木瓜蛋白酶酶解牡蛎制备牡蛎肽，以水解度为检测指标，通过单因素试验及响应面分析，确定最优酶解工艺参数：加酶量5 000 U/g，料液比1∶2（g/mL），酶解温度48.1 ℃，酶解pH 6.8，酶解时间4.7 h；最大理论水解度为30.34%，实际值为30.65%，证明响应面模型预测准确。产物主要为分子质量＜1 000 Da的寡肽，表明该工艺可实现对牡蛎的高效酶解。牡蛎肽中18种氨基酸齐全，必需氨基酸和鲜味氨基酸含量高，各必需氨基酸评分均高于或接近FAO/WHO推荐的标准模式，EAAI为91.68，表明该牡蛎肽具有较高的营养价值和鲜美风味，可用于开发牡蛎肽功能食品、调味品等，对于实现牡蛎的高值化利用有重要参考价值。