体外模拟消化对小麦低聚肽抗氧化活性影响

凌空，张铭晧，高丽辉，冯晓文，谷瑞增，刘文颖*

1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心（北京 100015）；2.北京林业大学生物科学与技术学院（北京 100083）；3.北京农学院食品科学与工程学院（北京 102206）

小麦谷朊粉又称小麦蛋白粉或者小麦面筋粉，是小麦淀粉生产中的副产品，通过除去小麦面团中的淀粉，再经过烘干处理所制成的蛋白复合物[1]。小麦谷朊粉的蛋白质含量在70%以上，作为植物源蛋白质，含有大量人体必需氨基酸、矿物质、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素A及维生素C等[2-3]。

小麦低聚肽是以小麦谷朊粉为原料，经调浆、定向酶解、特定的小肽分离、过滤、喷雾干燥等工艺获得的小分子多肽类混合物，主要成分是由2～6个氨基酸分子构成的小肽，分子质量低于1 000 Da。小麦低聚肽具有水溶性好、分散稳定、易吸收、生物活性强等特点。小麦低聚肽中氨基酸含量均衡，几乎与小麦谷朊粉一样，其中谷氨酸含量最高，大部分以谷氨酰胺的形式存在[4]。谷氨酰胺为人体内含量最丰富的氨基酸，在人体中发挥重要的功效，对肠道屏障功能有显著的保护作用。

机体在代谢过程中会产生一系列活性氧，正常情况下机体自身的防御体系可维持体内氧化与抗氧化平衡，防止过氧化反应。但是当机体受到环境毒物影响、自身发生衰老、处于精神紧张状态、某些外源性药物入侵时，此平衡会被打破，抗氧化体系发生紊乱，自由基代谢平衡失调，使机体处于氧化应激状态，进而造成生物膜及大分子物质发生脂质过氧化损伤，并且机体氧化应激状态与炎症、免疫力降低、衰老、心血管疾病、糖尿病、癌症等多种疾病的发生发展密切相关[5-8]。外源性抗氧化物质有助于维持体内的氧化还原平衡，而小麦低聚肽以其良好的吸收特性及天然安全特性得到广泛关注[9-10]。Zhu等[9]采用体外试验方法研究了小麦胚芽蛋白水解所得到的低聚肽的抗氧化活性，结果显示，低聚肽的抗氧化活性接近于亚油酸乳液体系中的α-生育酚，且具有清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）自由基、过氧化物和羟自由基（·OH）的活性。目前，对小麦低聚肽抗氧化活性的研究多集中在体外抗氧化指标的测定。研究采用胃蛋白酶和胰蛋白酶对小麦低聚肽进行体外模拟消化，探讨消化前后小麦低聚肽分子质量的变化；通过评价DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、总抗氧化能力（ABTS法）和氧自由基吸收能力（ORAC值），进一步研究小麦低聚肽消化前后抗氧化能力的变化，为相关功能性食品的开发提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦谷朊粉，安徽中弘生物工程有限公司；中性蛋白酶（≥1 600 AU/g）、碱性蛋白酶（≥400 000 DU/g），杜邦丹尼斯克公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Fluorescein（荧光指示剂）、偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH）、分子质量标准品、胃蛋白酶（≥250 units/mg），美国Sigma公司；胰蛋白酶（≥250 NFU/mg），美国Solarbio公司；乙腈（色谱纯），美国Fisher公司产品；ABTS自由基清除能力检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；其他分析纯试剂，北京化工厂。

HH-501型超级恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱，北京陆希科技有限公司；Spectra MR多功能酶标仪，美国Dynex；LC-20A高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪，美国MD公司；SI-114型电子天平，美国Denver Instrument公司。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦低聚肽的制备

利用中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解小麦谷朊粉。称取400 g的谷朊粉，用蒸馏水溶解并定容至5 L，加入片碱或盐酸调节pH，50 ℃下酶处理4 h，酶解结束后在100 ℃沸水浴条件下灭酶，冷却至室温后离心，经陶瓷膜吸附和超滤膜过滤后，喷雾干燥备用[11-12]。工艺路线如下：

小麦谷朊粉→酶解→离心→小麦肽粗品→吸附→过滤→喷雾干燥→小麦低聚肽

1.2.2 小麦低聚肽体外模拟消化

体外模拟胃液消化实验：将5.0 g小麦低聚肽和0.2 g NaCl溶解于去离子水中，用1.0 mol/L的HCl调溶液pH至2.0，加入0.05 g胃蛋白酶于37 ℃水浴恒温消化2 h，100 ℃沸水浴灭酶后冷却至室温，用1.0 mol/L NaOH溶液调节pH至7.5，定容至100 mL。空白对照不加胃蛋白酶，其余处理流程相同[13-14]。

体外模拟肠液消化实验：将5.0 g小麦低聚肽和0.68 g KH2PO4溶解于去离子水中，用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH至7.5，加热至37 ℃后，加入0.05 g胰蛋白酶，37 ℃恒温消化4 h后100 ℃沸水浴灭酶，冷却至室温，定容至100 mL。空白对照不加胰蛋白酶，其余处理流程相同[13-14]。

1.2.3 DPPH自由基清除率测定

将样品用去离子水稀释为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8个不同质量浓度梯度，分别与浓度为0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液等体积比例混合均匀，室温避光反应30 min，置于波长517 nm处测定吸光度Ay；同时以不同浓度的样品溶液与无水乙醇等体积混合，测得吸光度A1；用蒸馏水代替样品作为空白对照，与同体积0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液混合，测得吸光度A2[15]。根据公式计算得到对DPPH自由基清除率：

1.2.4 ·OH清除率测定

参照Fenton反应体系，对消化处理前后小麦低聚肽的·OH清除作用进行对比。将样品用去离子水稀释为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL 8个不同质量浓度梯度。分别将不同浓度的样品溶液与5 mmol/L FeSO4溶液、5 mmol/L水杨酸-无水乙醇溶液以1∶2∶2的体积均匀混合。试验组以1体积5.0 mmol/L H2O2溶液开启反应；对照组以1体积蒸馏水开启反应；空白对照组以蒸馏水代替样品。37 ℃恒温孵育1 h后于510 nm处测量吸光度，试验组、对照组和空白对照组的吸光度分别记为Aw、A1、A2[16]。根据公式计算得到对·OH的清除率：

1.2.5 总抗氧化能力测定

将ABTS溶液与过硫酸钾混合反应形成墨绿色ABTS+工作液，静置12 h，待工作液稳定后备用。使用前用pH 7.4，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）稀释35倍成为ABTS工作液，使其在734 nm处的吸光度为0.70±0.02。向96孔板的每个孔中加入200 μL ABTS工作液，同时在标准曲线检测孔中加入10 μL不同浓度的Trolox（水溶性维生素E）标准溶液，在样品检测孔加入10 μL样品溶液，缓缓混匀后室温孵育6 min，于734 nm处测定吸光度。样品的抗氧化能力以mmol/g Trolox表示[17]。

1.2.6 ORAC值测定

荧光96 孔板中加入25 μL样品，25 μL Trolox标准品（6.25，12.5，25，50，100，250，500 μmol/L）作为阳性对照（制作标准曲线），以及100 μL的Fluorescein（荧光指示剂，0.8 μmol/L），于37 ℃保温20 min，然后加入75 μL，150 mmol/L偶氮类化合物AAPH，荧光酶标仪激发波长485 nm，发射波长530 nm，每隔2 min测定1次，测定总长时间为120 min，以pH 7.4，75 mmol/L的PBS为空白对照；另外做不加AAPH的对照。根据标准曲线计算待测样品的ORAC值，结果表示为μmol/g Trolox[18-19]。

1.2.7 分子质量分布测定

利用高效液相凝胶色谱法测定小麦低聚肽的分子质量。色谱柱，TSKgel G2000 SWXL 300×7.8 mm；流动相，V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1；流速，0.5 mL/min；进样体积，10 μL；检测波长，220 nm；柱温，30 ℃。样品用流动相配制为1.0 mg/mL的溶液，并利用孔径0.2 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，通过高效液相色谱仪进行凝胶过滤，紫外检测器进行检测，最后通过GPC软件处理色谱数据。同时配制4种0.1 g/100 mL标准品溶液：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子质量189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子质量451 Da）、杆菌酶（分子质量1 450 Da）和细胞色素C（分子质量12 500 Da），制作分子质量标准曲线。

1.2.8 数据分析

数据利用Origin 8.5软件（OriginLab Corp.，Northampton，MA，USA）处理。试验结果用平均值±标准偏差表示，每组数据平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 小麦低聚肽消化前后的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除法是利用电子转移和电荷中和的原理，是评价物质抗氧化能力的一项重要指标。DPPH自由基在有机环境中是一种稳定的N离子自由基，在517 nm波长处具有最大吸收峰。当DPPH自由基的单电子被体系中自由基清除剂中和后，其溶液颜色由紫色变为浅黄或无色，直接表现为吸光度数值的下降。图1显示了经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化前后小麦低聚肽对DPPH自由基清除能力的变化。小麦低聚肽的DPPH自由基清除能力随浓度的升高而加强。未经处理的低聚肽清除能力稍强于消化后的低聚肽，IC50值分别为IC50胃蛋白酶处理=0.75 mg/mL，IC50胃蛋白酶对照=0.63 mg/mL，IC50胰蛋白酶处理=1.52 mg/mL，IC50胰蛋白酶对照=0.96 mg/mL。因此，小麦低聚肽模拟消化后的DPPH自由基清除活性略有下降，但仍可保持较高的水平。

图1 不同处理的小麦低聚肽对DPPH自由基清除作用

2.2 小麦低聚肽消化前后的·OH清除能力

·OH是体内最活泼的一种自由基，几乎能与所有生物大分子发生反应，氧化性极强，对人体危害性最高[20]。由图2可知，小麦低聚肽的·OH清除能力随浓度的升高而提升。经消化酶处理后，其·OH清除能力与未处理的相比，仅有轻微下降。IC50分别为IC50胃蛋白酶处理=14.82 mg/mL，IC50胃蛋白酶对照=12.85 mg/mL，IC50胰蛋白酶处理=11.01 mg/mL，IC50胰蛋白酶对照=9.83 mg/mL，说明小麦低聚肽对·OH清除能力具有较好的消化稳定性。

图2 不同处理的小麦低聚肽对·OH清除作用

2.3 小麦低聚肽消化前后的总抗氧化能力

通过ABTS自由基清除法评价小麦低聚肽消化前后的总抗氧化能力。此方法的原理是，以ABTS为显色引发剂，当加入氧化剂后，ABTS试剂在水溶液环境中可形成稳定的蓝绿色ABTS自由基，在波长734 nm处有最大吸收。当加入抗氧化性物质后ABTS自由基的电荷被中和，颜色变浅，吸光光度值随之下降，下降趋势可表明所检测物质抗氧化活性的强弱[21]。根据Trolox标准品绘制的ABTS标准曲线如图3所示。经计算，小麦低聚肽消化前后的总抗氧化能力见表1。与对照组相比，经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，小麦低聚肽对ABTS自由基的清除能力略有下降，但没有明显变化。因此推测，小麦低聚肽在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下没有发生大的结构和性质变化。

图3 ABTS标准曲线

表1 不同处理的小麦低聚肽的总抗氧化能力

2.4 小麦低聚肽消化前后的ORAC值

ORAC全称为oxygen radical absorbance capacity，被译为氧自由基清除能力或抗氧化能力指数，是目前抗氧化研究领域中为人们所关注的一个评价方法[22]。不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线见图4，绘制的标准曲线如图5所示，y=0.842x+0.091 3，R2=0.998 3。根据标准曲线，计算最终小麦低聚肽消化前后的ORAC值，如表2所示。小麦低聚肽经胰蛋白酶消化后，ORAC值略有提高，但没有明显变化；胃蛋白酶消化后，ORAC值降低了15.7%。推测经胃蛋白酶处理后，小麦低聚肽不同肽段中部分抗氧化氨基酸残基被消化而导致ORAC值降低。

图4 不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线

图5 Trolox的标准曲线

表2 不同消化方式下小麦低聚肽的ORAC值变化

2.5 小麦低聚肽消化前后的分子质量分布

由表3可知，小麦低聚肽的分子质量主要集中在150～1 000 Da，占总比例的70%以上，具有良好的水溶性、消化吸收性[23]。小麦低聚肽大多由2～10个氨基酸的短肽组成。胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，低聚肽的各区间分子质量分布变化很小，重均分子质量轻微减少，不超过0.3%。由此看出，小麦低聚肽具有较强的抗消化能力，小肽尤其是抗氧化性短肽基本不受蛋白酶作用的影响，这也进一步解释了小麦低聚肽消化后抗氧化活性得以保持的原因。

表3 不同处理的小麦低聚肽的分子质量分布

3 结论

酶解制得的小麦低聚肽，分子质量小于1 000 Da的部分占比在80%以上，有易吸收、溶解性好的特点。通过DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、总抗氧化能力和ORAC值测定试验，证明了酶法制备的小分子小麦低聚肽经模拟胃肠道消化后仍有较好的抗氧化活性，与未消化处理的相比变化不大。胰蛋白酶消化较胃蛋白酶消化对小麦低聚肽的抗氧化活性影响更小，保证了它在吸收过程中仍具有较强的抗氧化活性。试验证实了小麦低聚肽具有较强的消化稳定性和抗氧化活性，为其在天然功能性保健食品中的应用提供了思路和理论支持。