气相色谱质谱法检测鸡蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺

乔青青，郝莉花，巩凡，刘燕，赵芳

1. 河南省产品质量监督检验院（郑州 450047）；2. 河南省食品安全数据智能重点实验室（郑州 450047）

氟苯尼考又名氟甲砜霉素，是新一代氯霉素类动物专用广谱抗生素，其抗菌广谱、吸收好、体内分布广、安全高效，近年来已在美洲、亚洲和欧洲的20多个国家生产销售，被广泛用于畜牧和水产养殖中[1-3]。随着氟苯尼考在养殖中大量、不规范应用，它在畜禽、水产品等动物性食品中的残留问题也日益被重视[4-6]。氟苯尼考在动物体内会迅速代谢，主要代谢物为氟苯尼考胺。中国、美国及欧盟均规定了动物组织中氟苯尼考的最大残留限量[1]，农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定了氟苯尼考在动物食品中的最大残留量，标志残留物为氟苯尼考胺[9]。最新公布的GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中修订了氟苯尼考在动物体内的标志残留物为氟苯尼考及氟苯尼考胺，同时规定家禽产蛋期禁用[10]。因此，建立鸡蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同时测定的方法具有重要的意义。

目前，国内外对氟苯尼考及氟苯尼考胺的残留检测方法虽有报道[11-16]，但氟苯尼考和氟苯尼考胺极性差异大，若直接使用液相色谱质谱法测定较难维护色谱条件，衍生后使用气相色谱单级质谱法测定容易被假阳性干扰。研究建立的采用气相色谱飞行时间质谱法同时检测鸡蛋中氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺的残留。该方法针对鸡蛋的基质，通过衍生消除了极性差异，采用的飞行时间质谱法提高分辨率可以降低假阳性的干扰，因此，该方法适合同时检测鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

氟苯尼考、氟苯尼考胺标准品（Dr. Ehrenstorfer）；鸡蛋，市售；乙腈（TEDIA，色谱级）；

HLB固相萃取柱（60 mg，Oasis，PRiME HLB）；C18固相萃取柱（100 mg，Agilent Bond Elut C18）；氨水、乙酸乙酯、正己烷（分析纯）；衍生化试剂：N, O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1）（macklin）；试验用水为一级水。

气相色谱串联质谱仪（Agilent，7200，配有CI离子源）；旋涡混合器（Vortex Mixer，QL-866）；高速冷冻离心机（Dynamica，Velocity 14R）；氮吹仪（厦门科睿特，TTL-DC）；电子天平（上海箐海仪器有限公司，FA2004N）。

1.2 样品前处理

鸡蛋样品经去壳，均匀制备后，准确称取（5± 0.2）g试样，精确到0.000 1 g，于50 mL具塞塑料离心管中，加25 mL 98∶2乙酸乙酯-氨水溶液，涡动1 min，以12 000 r/min离心5 min，取上清液于50 mL离心管中。残渣加入25 mL乙酸乙酯-氨水溶液，重复提取2次，合并有机相，50 ℃水浴氮吹吹干。

净化：准确加入3 mL水溶解混匀并准确量取1 mL于活化后的C18固相萃取小柱，加入4 mL水并控制流速2～3 mL/min，抽干后再加入6 mL甲醇并控制流速2～3 mL/min，抽干并收集甲醇相，50 ℃氮气吹干。

1.3 衍生化

在氮气吹干的提取物中加入200 μL乙腈复溶，再加入衍生化试剂100 μL，盖塞并涡旋混合20 s，在60 ℃水浴反应30 min。取出冷却至室温，在50 ℃的水浴中氮气吹干，准确加入1.0 mL正己烷，涡旋混匀，供气相色谱飞行时间质谱测定。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱Agilent HP-5MS UI（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；载气，He（99.999%）；恒流模式，柱流量1.2 mL/min；不分流进样，进样量1 μL；进样口温度250 ℃；柱初始温度60 ℃，保持1 min，程序升温以20 ℃/min至160 ℃，然后10 ℃/min至260 ℃保持3 min；传输线温度280 ℃。质谱条件：负化学源（NCI）；离子源温度，150 ℃；接口温度，250 ℃；反应气，甲烷（纯度≥99.99%）；溶剂延迟时间，13 min；采集模式，SCAN，扫描m/z= 180～450；采集速率5.00质谱图/s。

1.5 测定方法

取样品和标准溶液各1 μL，通过自动进样器注入气相色谱仪中进行分析，以保留时间、定性离子丰度比定性，定量离子丰度外标法计算样品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。目标化合物特征离子质荷比见表1，质谱图见图1。

图1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物质谱图

表1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物特征离子质荷比

1.6 标准曲线绘制

母液配制：用感量0.000 1 g的电子天平准确称取10.0 mg标准品，溶于10.00 mL甲醇中，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准母液。

基质标准曲线的制作：将母液加入至提取、净化后的阴性样品残渣中，配制成2，5，10，50和100 ng/mL的标准工作溶液，取1.00 mL工作溶液，氮气吹干后衍生化，以进样浓度为横坐标、定量离子丰度为纵坐标，作基质标准曲线。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱洗脱溶剂的优化

将混合标准工作液加入空白基质中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考与氟苯尼考胺加标量100 μg/kg，分别使用2，3，4，5和6 mL水淋洗小柱，后用6 mL甲醇淋洗，洗脱后溶液经处理，仪器测定，以化合物加标回收率指标做单因素试验，考察结果如图2所示。

由图2可以看出，洗脱剂水的用量会显著影响氟苯尼考胺的回收率，洗脱量为4 mL时，回收率为70%，已经不满足检验回收率要求；洗脱量为3 mL时，可以保证氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，同时也能够尽可能将极性杂质洗脱出来。

图2 洗脱剂水的用量对回收率的影响

将混合标准工作液加入空白基质中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考与氟苯尼考胺加标量100 μg/kg，使用3 mL水淋洗小柱，抽干后分别使用4，5，6，7和8 mL甲醇淋洗，洗脱后溶液经处理，仪器测定，以化合物加标回收率指标做单因素试验，结果如图3所示。

由图3可以看出，当洗脱剂甲醇用量超过5 mL时，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，满足检验回收率要求，这说明这2种化合物已经洗脱出小柱，洗脱量的增加会导致弱极性杂质同时洗脱出来，影响检验效果，因此甲醇用量应尽可能减少，然而氟苯尼考胺在甲醇用量超过6 mL时才能充分洗脱，因此甲醇用量在6 mL较合适，在此条件下，2种化合物回收率均在90%～110%，满足检验回收率要求。

图3 洗脱剂甲醇的用量对回收率的影响

2.2 溶剂提取次数对回收率的影响

将混合标准工作液加入均质好的样品中，氟苯尼考与氟苯尼考胺加标量100 μg/kg，涡旋混匀，然后加入25 mL氨化乙酸乙酯，涡旋混匀后放入离心机，以12 000 r/min，离心5 min，用吸管将上清液转移并净化后上机测试，重复提取过程，以化合物累计回收率为指标，提取次数对提取量的影响见图4。

由图4可以看出，随着提取次数增加，3种化合物累计回收率均升高，当提取次数2次时，回收率已经超过80%，回收率和检出限均可以满足检验要求。因此将提取次数设定为2次可以满足检验要求。

图4 提取次数对回收率的影响

试验将溶剂用量减少至15 mL或20 mL，离心后上清液较难吸取，不易操作，因此单次萃取量25 mL较适宜。

2.3 线性范围、检出限、精密度、回收率

用甲醇将标准母液配制成2，5，10，50和100 ng/mL的标准工作溶液，做线性回归，氟苯尼考R2= 0.999，氟苯尼考胺R2=0.998。通过阴性样品中添加标准品的方法进行检出限试验。结果显示，氟苯尼考和氟苯尼考胺添加水平为0.5 μg/kg，当质量提取精确度为0.002%时，信噪比S/N为5.6和3.7，由此可以确定该方法氟苯尼考和氟苯尼考胺的检出限为0.5 μg/kg。在已知的阴性样品中分别添加0.5，1.5和10.0 μg/kg的3个水平2种标准品的混合工作溶液，每个水平重复3次，氟苯尼考及氟苯尼考胺的回收率及相对标准偏差（RSD）（n=3）见表2。

表2 鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺加标回收率及相对标准偏差RSD（n=3）

3 结论

试验建立了气相色谱飞行时间质谱同时检测鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的方法，采用C18固相萃取柱作为前处理净化柱能够保证目标化合物具有较高回收率。试验采用的衍生方案消除了氟苯尼考与氟苯尼考胺较大的极性差异，采用的飞行时间质谱法提高分辨率，可以降低假阳性的干扰，该方法简单、快速、高效，可用于鸡蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同时测定。