酶法联合超声辅助提取西瓜番茄红素工艺优化

刘义庆，王晓明，刘嫚

1. 江汉大学化学与环境工程学院（武汉 430056）；2. 江汉大学生命科学学院（武汉 430056）

西瓜是夏季时令水果，味道甘甜多汁，清爽解渴；含有丰富的矿物盐，维生素和糖类等营养成分；对治疗肾炎、糖尿病及膀胱炎等疾病有辅助疗效。在我国，西瓜的播种面积约200万 hm2，年总产量世界第一，约8 000万 t[1]。西瓜含有大量番茄红素、葡萄糖、苹果酸、果糖、蛋白氨基酸及丰富的维生素C等营养物质[2]。西瓜不但营养价值高、食用安全，且不含脂肪和胆固醇，堪称“盛夏之王”。

番茄红素是一种在自然界中广泛分布的不饱和类胡萝卜素，在人体各组织器官中也均有存在[3]。番茄红素的最大特点是抗氧化性强，其抗氧化能力是维生素E抗氧化能力的百余倍，它是至今为止所发现的抗氧化能力最强的物质之一[4]。它具有消除自由基、预防心血管疾病、降血糖、促进细胞间的连接与传导、防癌抗癌、提高免疫力等多种生理功能[3-5]。番茄红素主要从植物资源中提取获得，也可应用微生物发酵[6]、化学合成[7]等方法制备。目前国内外主要以番茄为原料对番茄红素进行一系列的研究工作[8-13]。

番茄红素是成熟西瓜果实的主要色素物质，与等质量的生番茄相比，西瓜番茄红素含量比番茄高40%左右，且无需加热等加工过程就可直接被人体吸收[14-15]。从西瓜果实中提取番茄红素的研究已经越来越受到人们的重视[16-24]。西瓜番茄红素的提取，见诸报道的提取方法主要有有机溶剂浸提法[16-18]、微波辅助提取法[19]、酶辅助提取法[20]、超声波辅助提取法[21]、微波超声联合辅助提取法[22]、超临界二氧化碳流体提取法[23-24]等。而采用酶联合超声波辅助从西瓜中提取番茄红素还鲜见报道。酶辅助提取和超声波辅助提取在提取植物生物活性时相较于其他提取方法，都具有仪器简单、操作方便、成本低、投资少、提取效率高的特点[26-28]。酶与超声波联合辅助提取在植物色素及生物活性物质提取时也得到广泛应用[29-30]。针对果胶酶、纤维素酶对西瓜进行酶解作用的条件进行了研究，并通过正交试验筛选出最佳的酶辅助提取西瓜番茄红素工艺。同时研究了超声波功率、超声作用温度、超声作用时间、料液比等因素对西瓜番茄红素的提取的影响，也通过正交试验筛选出最佳的超声波辅助提取西瓜番茄红素工艺。根据酶辅助和超声波辅助提取试验的结果，选择影响最大的超声波功率、超声时间、酶量、酶的作用pH等因素为主要研究对象，控制酶的比例、超声波的功率、超声波的频率等因素不变，以番茄红素提取率作为响应值，采用Box-Behnken试验设计法试验并进行响应面分析优化西瓜番茄红素的最佳提取工艺。试验对西瓜重要营养成分番茄红素的提取和合理利用具有重要参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西瓜，本地市售；切开，取果肉，去籽，过滤除汁，充分研磨备用。

纤维素酶、果胶酶，上海如吉生物科技发展有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂；醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验室用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

722E型可见光光度计，上海光谱仪器有限公司；JY3002电子天平，上海精密科学仪器有限公司；FDL-DTD5200超声波清洗仪，南京凡帝朗信息科技有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；PHS-2C型精密酸度计，上海精科雷磁；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义予华仪器有限责任公司；电烘箱，上海福玛实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

新鲜西瓜→研磨预处理→酶解→溶剂超声萃取→测吸光度→计算提取量→计算提取率

1.3.2 西瓜番茄红素的吸收光谱

称取10 g经研磨预处理后的西瓜果肉样品，置于100 mL带塞锥形瓶中，加入25 mL石油醚，在室温下振摇中浸提2 h，静置，取适量上层提取液稀释定容至10 mL，用分光光度计测西瓜番茄红素溶液的吸收光谱。

1.3.3 提取西瓜番茄红素溶剂的选择

目前，提取西瓜番茄红素的采用溶剂法主要有乙酸乙酯、丙酮-氯仿、石油醚-丙酮、含2%二氯甲烷的正己烷、体积比为7∶1的乙酸乙酯-丙酮[16,21]等。根据文献及预试验的结果，体积比为7∶1的乙酸乙酯-丙酮提取西瓜番茄红素的效率最高，故采用体积比为7∶1的乙酸乙酯-丙酮作为提取西瓜番茄红素的溶剂。

1.3.4 番茄红素标准曲线的制备与西瓜番茄红素提取率的测定

1.3.4.1 番茄红素标准曲线的制备

精密称取1.00 mg番茄红素标准品，石油醚溶解，定容至10 mL，得100 μg/mL储备液。精密吸取0.10，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mL储备液于10 mL容量瓶，用石油醚稀释至刻度，获得1.00，5.00，10.00，15.00，20.00和25.00 μg/mL的标准品溶液，测定其在选取502 nm处的吸光度。以标准品吸光度对标准品质量浓度c（μg/mL）作线性回归。

1.3.4.2 西瓜果肉样品中番茄红素总量的确定

称取经研磨预处理后的西瓜果肉样品10 g，置于100 mL带塞锥形瓶中，加入25 mL体积比为7∶1的乙酸乙酯-丙酮，在室温下振摇中浸提2 h，过滤，反复提取至样品中番茄红素被提取完全。合并提取液，定容于250 mL容量瓶中，测定吸光度，从标准曲线可获得供试品浓度c，计算10 g西瓜果肉样品中番茄红素总量。

1.3.4.3 番茄红素提取率的计算方法

在某组试验中，对所得提取液稀释一定倍数后，利用紫外-可见光分光光度计测定吸光度，如果稀释倍数相同，可根据吸光度的大小得到提取率。若稀释倍数不同，根据吸光度可从标准曲线可获得供试品质量浓度c。

式中：c为供试品质量浓度，μg/mL；V为提取液体积，mL；f为稀释倍数；W为西瓜果肉样品中番茄红素总质量，g。

1.3.5 酶辅助提取单因素试验设计

称取经研磨预处理后的西瓜果肉样品10 g，选择酶的添加量、酶作用温度、酶作用时间、酶作用pH值这4个对西瓜番茄红素提取效果有影响的工艺参数进行单因素试验。各因素的水平梯度设置分别为：改变酶加入量为西瓜果肉质量的 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%。酶解时间考察因素水平为1，2，3，4和5 h。酶解温度考察因素水平为35，40，45，50，55和60 ℃。酶作用pH考察因素水平为3，4，5，6，7和8。经酶作用预处理后，冷却，加25 mL溶剂萃取2 h，每个试验条件下平行提取3份，取平均值，以1.3.4的方法计算番茄红素提取率。并比较使用单一纤维素酶、单一果胶酶及二者复合酶作用效果.

1.3.6 酶辅助提取正交试验

为了比较各因素对西瓜番茄红素提取效率的影响程度，根据单因素试验结果选取纤维素酶果胶酶的混合酶添加量、酶作用温度、酶作用时间、酶作用pH 4个因素进行正交试验。

1.3.7 超声波辅助提取单因素试验

称取经研磨预处理后的西瓜果肉样品10 g，加入提取溶剂。选择超声波功率、超声作用温度、超声作用时间、料液比这4个对西瓜番茄红素提取效果有影响的工艺参数进行单因素试验。超声波功率考察因素水平为125，150，175，200，225和250 W；超声作用温度考察因素水平为35，40，45，50，55和60 ℃；超声作用时间考察因素水平为5，10，15，20和25 min；料液比考察因素水平为1∶3，1∶5，1∶7和1∶9 g/mL。取等量萃取液稀释定容，在选定波长下测定溶液的吸光度，每个试验条件下平行提取3份，取平均值，以1.3.4的方法计算番茄红素提取率。

1.3.8 超声波辅助提取正交试验

为了比较各因素对西瓜番茄红素提取效率的影响程度，根据单因素试验结果选取超声波功率、超声作用温度、超声作用时间、料液比4个因素进行正交试验。

1.3.9 响应面法优化酶联合超声波提取西瓜番茄红素工艺

根据酶辅助提取正交试验和超声波辅助提取正交试验对番茄红素提取率的影响试验结果，以番茄红素提取率作为响应值，控制酶的比例、酶作用温度、酶作用时间、超声波温度、料液比等因素不变。选择对西瓜番茄红素提取有显著影响的超声波的功率、超声时间、酶量、酶的作用pH的4个因素为自变量，采用Box-Behnken试验设计软件通过响应面法优化番茄红素最佳的提取条件并验证试验结果。

2 结果与分析

2.1 西瓜番茄红素的吸收光谱与分析检测

西瓜番茄红素的吸收光谱如图1所示。

图1 西瓜番茄红素的吸收光谱

由西瓜番茄红素的吸收光谱可知，番茄红素在455，481和502 nm处各有一个吸收峰，结合相关文献报道，故选用502 nm作为番茄红素含量测定的波长，探讨试验条件对番茄红素提取效果的影响。

2.2 标准曲线的制备

番茄红素的标准曲线见图 2。其相关系数为0.999 8，表明所得到的标准曲线具有良好的线性关系。由试验测得标准曲线的线性范围为 0.180～5.796 μg/mL，ε=2.558×105。从而计算出提取液中番茄红素的含量，计算提取量。

图2 番茄红素的标准曲线

2.3 酶对提取西瓜番茄红素影响的单因素试验

根据单因素预试验结果，纤维素酶的最佳添加量为西瓜果肉质量的0.40%，纤维素酶的最佳作用温度为55 ℃，最佳作用时间为3 h，酶解最佳pH为5.0。

单因素试验结果还表明：果胶酶的最佳添加量为西瓜果肉质量的0.10%。果胶酶的最佳作用温度为50℃。最佳作用时间为2 h。酶解最佳pH为4.0。

根据单因素试验结果设计，混合酶中纤维素酶和果胶酶的最佳质量比为4∶1，最佳添加量为西瓜果肉质量的0.50%。

2.4 混合酶辅助提取番茄红素的正交试验优化

根据单因素试验结果，纤维素酶和果胶酶的最佳质量比为4∶1，纤维素酶、果胶酶的最佳作用温度分别为55 ℃和50 ℃。最佳作用时间分别为3 h和2 h。酶解最佳pH分别为5.0和4.0。故设计如下正交试验方案，正交试验因素和水平见表1。

表1 混合酶辅助提取番茄红素的正交试验表

从表2可知，利用混合酶酶解提取番茄红素时，4个因素的影响大小顺序为A＞C＞D＞B，因此说明酶的添加量对从西瓜中提取番茄红素的影响最大，然后是pH的影响，其次是反应时间的影响，最后是温度的影响。极差分析最佳组合为A3B3C2D2，所以酶解法提取西瓜番茄红素的最佳工艺：质量比为4∶1的纤维素酶、果胶酶混合酶添加量为0.6%，酶解温度为50℃，酶解pH为4.5，酶解时间为2 h。采用酶解法最佳工艺进行提取并与直接用溶剂法提取比较，可使番茄红素提取率增加56.1%。

表2 混合酶辅助提取番茄红素的正交试验结果

2.5 超声波辅助提取西瓜番茄红素影响的单因素

超声辅助提取西瓜番茄红素单因素预试验结果显示：超声辅助提取西瓜番茄红素的最佳超声波功率为225 W，超声波辅助提取的最佳温度为55 ℃，最佳超声提取时间为20 min，最佳料液比为1∶5 g/mL。

2.6 超声波辅助提取西瓜番茄红素影响的正交试验优化

根据超声辅助提取西瓜番茄红素预试验的结果，设计出超声辅助提取西瓜番茄红素正交试验因素和水平如表3所示。按设计的正交试验因素和水平表进行试验，试验结果如表4。

表3 超声波辅助提取西瓜番茄红素影响的正交试验表

从表4可知，利用超声波辅助提取番茄红素时，4个因素的影响大小顺序为A＞C＞D＞B，即超声波功率对提取西瓜番茄红素的影响最大，其次是超声时间、料液比，最后是提取温度。直观分析结果得到最佳表现组合为A3B2C4D3；极差分析得到最佳组合为A3B2C3D3。超声波辅助提取西瓜番茄红素的最佳工艺为超声波功率225 W，超声温度50 ℃，超声时间20 min，料液比为1∶5 g/mL。按最佳工艺提取并与用溶剂法提取进行对比，最佳工艺提取可使提取率增加61%。

表4 超声波辅助提取西瓜番茄红素影响的正交试验结果

2.7 响应面法优化与分析

2.7.1 Box-Behnken试验设计法筛选重要因素

根据对番茄红素提取率产生影响的单因素试验结果，以番茄红素提取率作为响应值，控制酶的比例、酶作用温度、酶作用时间、超声波温度、料液比等因素不变。选择对西瓜番茄红素提取有显著影响的超声功率、超声时间、酶量、pH的4个因素为自变量，根据 Box-Behnken的试验设计原理，设计四因素三水平的响应面试验，试验因素与水平见表5。试验共设计29个试验点，包含了析因点和零点，其中析因点为自变量取值在 A、B、C、D所构成的三维顶点，零点为区域的中心点。零点试验重复3次，用以估计试验误差。17～19号是中心试验，其余是析因试验。试验分析方案及结果见表6。

表5 响应面分析因素与水平

表6 响应面分析方案及试验结果

2.7.2 方差分析及拟合数学模型的建立

将所得试验数据用Design-Expert 8.0.5b软件进行多元回归拟合，得到番茄红素提取液吸光度与超声温度（X1）、超声时间（X2）、酶量（X3）和pH（X4）的4个因素变量的二次回归方程模型为A=0.83+0.018X1+0.068X2+0.057X3+0.032X4-0.020X1X4-0.051X12-0.048X22-0.053X32-0.036X42。方差分析及显著性检验结果见表7。

由表7可知回归方程F模型=31.6，p＜0.000 1，因此该方程的回归模型差异极显著R2=0.969 3，从回归模型的决定系数的大小可以看出，响应值的变化有96.93%来源于所选变量。回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系.回归方程的失拟检验p=0.083 1＞0.05，失拟性检验结果不显著。该模型与实际试验拟合较好，试验误差小，预测值与实测值具有高度相关性，可以用于酶超声波辅助提取西瓜番茄红素的理论预测，确定最佳提取工艺条件。分析可知，模型中一次项X1、X2、X3、X4，二次项中X1X4差异显著，X12、X22、X32、X42的p＜0.000 1，差异极显著。模型中除X1X4外，其他交互项差异性不显著。根据番茄红素的热稳定性特征，设定超声功率范围为200～250 W，超声时间范围为20～50 min，酶添加量为0.6%～1.0%，酶解pH为4.5～7.0，通过Design-Expert 8.0.5b软件优化功能优化，得出酶超声波辅助提取番茄红素的最优工艺参数为超声功率范围为200～250W，超声时间28.49 min、酶量0.65%、pH 5.29。番茄红素提取率理论预测值为0.879 μg/g。

表7 回归方程方差分析

2.7.3 验证试验得番茄红素提取的最佳工艺条件

为了进一步验证试验结果的准确性，考虑到实际操作性，将最佳工艺条件修正为超声功率225 W、超声时间28 min、酶量0.65%、pH 5.3。并进行3次平行试验，番茄红素提取率平均值为0.872 μg/g。与理论预测值误差仅为0.8%。验证结果与预测值偏差较小，说明采用响应面法优化得到的工艺参数是可行的。同时，通过与常规提取法进行对比，酶超声波辅助提取可以缩短提取时间，提高提取效率。

3 结论与讨论

1) 添加纤维素酶、果胶酶及由纤维素酶、果胶酶组成的混合酶对提取西瓜番茄红素均有显著性影响，以添加混合酶（纤维素酶、果胶酶质量比为4∶1）时提取西瓜番茄红素的效果最佳。同时酶的添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间都对提取效率有直接而明显作用。正交试验结果表明，混合酶酶解各影响因素的影响大小顺序为混合酶量＞酶解pH＞酶解时间＞酶解温度。混合酶酶解最佳工艺为添加混合酶量0.6%，酶解温度50 ℃，酶解pH 4.5，酶解时间2.0 h。

2) 超声波辅助对提取西瓜番茄红素的影响显著：超声波最佳功率为225 W，超声波提取的最佳温度55℃。超声提取的最佳时间是20～25 min，最佳料液比为1∶5 g/mL。

3) 通过Design-Expert 8.0.5b软件进行试验设计，考察从西瓜中提取番茄红素影响最大的4个因素，并对试验结果进行响应面分析表明：番茄红素提取液提取率与超声功率（X1）、超声时间（X2）、酶量（X3）和pH（X4）的4个因素变量的二次回归方程模型为Y=0.83+0.018X1+0.068X2+0.057X3+0.032X4-0.020X1X4-0.051X12-0.048X22-0.053X32-0.036X42。4个因素的最佳工艺参数是：超声波功率为225 W，超声时间28 min、酶量0.65%、pH 5.3。根据最佳工艺参数进行试验验证，提取液吸光度与理论预测误差仅为0.8%。

4) 提取西瓜番茄红素最佳工艺：向均匀的西瓜糊中添加酶量为西瓜糊质量的0.65%的纤维素酶果胶酶混合酶，混合酶中纤维素酶果胶酶的质量比为4∶1，调节体系pH为5.3，温度50 ℃下，酶解2.0 h；然后按料液比为1∶5 g/mL加入体积比为7∶1的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂，温度55 ℃，225 W的功率下，超声提取28 min。