茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生的影响

綦国红，张佳怡，杨志萍，陈贵堂

中国药科大学工学院（南京 211198）

茶多酚（tea polyphenols，简称TP），是茶叶中多酚类物质的总称，主要化学成分为儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花色苷类、酚酸类等。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主要成分，占茶多酚总量的65%～80%[1]，是形成茶叶色香味的主要成分之一，也是茶叶保健功能的主要成分之一。

茶多酚是一种广谱的抗菌剂，其对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）以及其他肠道致病菌具有不同程度的抑制和杀伤作用。茶多酚通过与细菌细胞膜结合使得细胞膜的通透性增加，其内容物、金属离子和蛋白质外泄，最终导致细菌代谢发生紊乱，从而产生直接的抗菌作用[2-3]。另外，茶多酚还能清除有害自由基，具有很强的抗氧化作用[4]，因此茶多酚常用于食品防腐保鲜。

金黄色葡萄球菌是人和动物正常菌群的微生物，肉、蛋、奶及其制品常受此菌的污染[5]。并且它还能黏附在生物或非生物表面形成生物膜，来庇护该菌不受杀菌剂的作用。细菌生物膜的形成受许多因素影响，如细菌自身所处的环境因素会影响生物膜的产生[6-8]。试验研究不同环境条件下茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制作用，为茶多酚在生产上应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料、试剂

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），实验室保藏。茶多酚，合肥博美生物科技有限公司；结晶紫草酸铵染色液，永安化学实验室出品；胰蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；酵母提取物，Oxoid Ltd.；氯化钠，西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-F160全温振荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；UV-1800PC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；ELxTM800多功能酶标仪，美国博腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌浓度（MIC）的测定

测试菌充分活化后，按1%接种量接种新鲜LB培养基，在37 ℃ 150 r/min条件下恒温振荡培养，至菌体密度OD600nm达到0.3左右，分装试管。按比例加入茶多酚水溶液，使茶多酚的终质量浓度分别为2，4，6，8，10，12和14 mg/mL，约培养12 h，观察各试管中菌的生长情况，判定MIC。

1.3.2 对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制作用

参照文献[9]，测试菌充分活化后，按照1%接种量接种新鲜LB培养基，于37 ℃ 150 r/min恒温振荡培养，当菌体OD600nm达到0.3左右时，停止培养。将含有不同浓度的茶多酚溶液与菌液混合，使茶多酚终浓度分别为0.5，1和2MIC，加入锥形瓶中，将0.5 cm×0.5 cm的无菌输液管片置于锥形瓶中，于37 ℃静置培养48 h，弃掉培养液，添加新鲜的LB培养基和茶多酚，继续培养48 h。取出输液管片，用无菌水冲洗表面浮菌，于45 ℃干燥30 min，用0.2%的结晶紫溶液染色3 min。用无菌水洗掉多余染色剂，于45 ℃干燥30 min，将处理好的输液管片放入96孔板中，加入200 μL无水乙醇洗脱，取出输液管片，用酶标仪测570 nm处的吸光度。按照式（1）计算抑制率。

1.3.3 茶多酚在不同NaCl浓度下对生物膜产生的影响

按1.3.2的方法，茶多酚终浓度为1MIC，NaCl终质量浓度分别为20和30 mg/mL，并设置相应的对照组。

1.3.4 茶多酚在不同pH条件下对生物膜产生的影响

按1.3.2的方法，将菌液pH调为3，5，7，9和11，茶多酚终浓度为1MIC，进行测定。

1.3.5 茶多酚在不同温度条件下对生物膜产生的影响

按1.3.2的方法，茶多酚终浓度分别为0.5，1和2MIC，分别于28和37 ℃静置培养48 h，进行测定。

1.3.6 茶多酚不同添加时间对生物膜产生的影响

按1.3.2的方法，分别在0，4，8，20和30 h加入茶多酚，使终浓度为1MIC，对照组为不加茶多酚，在37℃下静置培养48 h后，进行测定。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对金黄色葡萄球菌的MIC

根据培养结果，8 mg/mL茶多酚是无菌生长的最低质量浓度，因此判定茶多酚对金黄色葡萄球菌的MIC为8 mg/mL。

2.2 茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制作用

由图1可知，当茶多酚浓度为0.5，1和2MIC时，其对金黄色葡萄球菌生物膜的产生具有抑制作用。经T检验，p＜0.01，差异极显著。生物膜的抑制率分别为49.8%，66.1%和67.8%，随茶多酚浓度升高而增大。因此，茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生具有抑制作用。

2.3 茶多酚在不同NaCl浓度条件下对生物膜产生的影响

由图2可知，金黄色葡萄球菌在高NaCl浓度下，生物膜形成量与空白组相比略下降但变化不大，经T检验，加盐试验组与空白组相比无差异（p＞0.05）。添加茶多酚又添加NaCl的试验组与只加茶多酚组相比差异显著（p＜0.05），即加盐后茶多酚组的生物膜形成量明显减少。金黄色葡萄球菌为耐盐菌，在高盐浓度条件下能够生长，但盐的存在可以增强茶多酚对生物膜产生的抑制作用。

图1 茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制作用

图2 茶多酚在不同NaCl浓度下对生物膜产生的影响

2.4 茶多酚在不同pH条件下对生物膜产生的影响

茶多酚水溶液在pH 2～7范围内较稳定，抑菌作用效果明显。由图3可知，在pH 7～9范围内，生物膜量较大，因为此条件下茶多酚的抑菌效果较弱，也是金黄色葡萄球菌适宜生长的pH。当pH为5时，生物膜产生量减少。当pH为3时，生物膜产生量急剧下降。因此，酸性条件加强了茶多酚的作用效果。但pH为11时，茶多酚不稳定，失去了抑菌作用。因此推测pH为11时，生物膜产量急剧下降是因为强碱对该菌的抑制作用所致。

2.5 茶多酚在不同温度下对生物膜产生的影响

经T检验，当茶多酚为1和2MIC时，在37 ℃与28℃条件下，生物膜的形成量无明显差异（p＞0.05）。当茶多酚为0.5MIC时，在37 ℃与28 ℃条件下，生物膜的形成量有差异（0.01＜p＜0.05）。由此可见，在37 ℃与28 ℃ 2种温度条件下培养，茶多酚对生物膜的形成量影响不大。但2种不同温度条件对金黄色葡萄球菌生长的影响较大，37 ℃为最适生长温度，因此37℃下空白对照组的生物膜形成量明显高于28 ℃下的空白组（图4），且差异极显著（p＜0.01）。

图3 不同pH下茶多酚对生物膜产生的影响

图4 不同温度下茶多酚对生物膜产生的影响

2.6 茶多酚不同添加时间对生物膜产生的影响

经T检验，在0和4 h添加茶多酚，形成的生物膜量与对照相比差异极显著（p＜0.01）；8 h及以后添加茶多酚，形成的生物膜量与对照相比差异不显著（p＞0.05）（见图5）。由此可知，加入茶多酚的时间越早，其对生物膜的抑制效果越好。随着茶多酚加入时间的推迟，抑膜作用显著减弱，培养20 h后再加茶多酚对生物膜的产生基本无抑制作用。可能是茶多酚主要对早期生物膜的形成具有抑制作用，对已经形成的成熟生物膜的破坏效果不大。

图5 茶多酚不同添加时间对生物膜产生的影响

3 结论

试验旨在测定茶多酚对金黄色葡萄球菌生物膜的定量抑制作用以及研究不同环境因素对茶多酚抑制生物膜效果的影响。结果表明，当茶多酚浓度为0.5，1和2MIC时，其对金黄色葡萄球菌生物膜的形成有明显抑制作用，抑制作用随浓度升高而增强。20 mg/mL和30 mg/mL NaCl以及酸性环境可以明显增强茶多酚对生物膜的抑制效果；28 ℃与37 ℃培养对茶多酚的抑膜作用基本无影响；加入茶多酚时间越早，其对生物膜的抑制效果越好，培养20 h再加入茶多酚对生物膜几乎无抑制作用。