响应面法优化高纯度石榴酸制备工艺

檀美娟，张宇臣，陈小娥，袁高峰*

浙江海洋大学食品与药学学院（舟山 316022）

共轭脂肪酸是对具有共轭双键体系的多不饱和脂肪酸位置和立体异构体的通称[1]。共轭脂肪酸可以是双烯、三烯、四烯形式，最常见的共轭脂肪酸是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，也就是共轭亚油酸（CLA）和共轭亚麻酸（CLNA）。CLNA自然存在于植物的种子中，天然资源非常丰富，由于双键的位置和构型不同有不同的异构体，石榴酸是其中研究最为广泛的异构体之一[2]。石榴酸是9，11，13位双键共轭，与9，11-CLA具有共同的9，11位共轭结构，与亚麻酸一样是补充人体缺乏ω-3系列不饱和脂肪酸的理想成分[3]，主要存在于石榴籽和栝楼籽中，其含量分别占75%和35%[4-5]，因其主要来源于石榴而得名[6]。近年来，各种体外、动物和人体试验均表明，石榴酸等共轭亚麻酸具有抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗氧化和抗炎等的功能[7-12]，这引起了学者广泛的研究兴趣[13-14]。研究表明，石榴酸能在大鼠血浆和组织器官中及体外培养的细胞中吸收分布[15-17]，通过人体试验研究发现，石榴酸能整合到人体血浆中[18]。为研究石榴酸生理功能及把石榴酸作为功能因子推广应用，有必要对石榴酸分离纯化工艺进行研究。

低温结晶法是常用的分离纯化多不饱和脂肪酸的方法。低温结晶法利用饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸凝固点上的差异使两者分离，将混合脂肪酸溶于有机溶剂，在低温环境中静置使其析出结晶，并迅速分离出晶体，从而达到饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分离的目的[19]。低温下可使不饱和脂肪酸结晶的更为充分，收率较高，生产设备简单，成本较低，且低温下多不饱和脂肪酸不易发生氧化，是提纯多不饱和脂肪酸的有效方法。试验以低温溶剂结晶法对石榴酸的分离纯化工艺进行优化，以期制备高纯度石榴酸。

1 材料与方法

1.1 试验材料

石油醚（沸程60～90 ℃）、正己烷、95%乙醇、无水乙醇、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、NaCl、无水硫酸钠、甲苯、硫酸、甲醇、甲醇钠、乙腈、丙酮（均为分析纯）。

1.2 试验主要设备

安捷伦7890B气相色谱仪（美国Agilent公司）；A-1000s旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；sk5210HP超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市大地自动化仪器厂）；85-1恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；LXJ-ⅡB低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；EL-303电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）仪器有限公司）；DFT-250手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；超低温冰箱（杭州宝诚生物技术有限公司）；美的-BCD-246-CMA冰箱（合肥美的荣事达冰箱有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 石榴籽油制备

石榴籽烘干去除杂物，高速粉碎机打成粉末，过80目筛，用石油醚做溶剂，40 ℃温度下，超声1 h后保温过夜，采用布氏漏斗过滤，旋转蒸发回收溶剂，得到石榴籽油[20]，加BHT存储于冰箱上层待用[19]。

1.3.2 石榴籽油脂肪酸组成分析

脂肪酸采用酸法甲酯化[21]。取少量晶体于玻璃离心管中，加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol/L硫酸甲醇溶液，往离心管中加入2滴50 mg/L BHT溶液，盖好盖子，充分振荡，于55 ℃皂化反应20 min（不时振荡），甲酯化反应后冷却到室温。加入1 mL饱和盐水和2 mL正己烷，充分振荡，以1 500 r/m离心10 min。取上层液于1支装有2 mL蒸馏水的干净试管中，振摇，静置。取上层液于一加有无水硫酸钠的玻璃管中，摇匀，将液体小心转移到干净样品瓶中。

色谱条件：色谱柱HP-INNOWAX（60 m×0.320mm，0.5 μm）；程序升温为200 ℃恒温保持 2 min，以 20 ℃/min升温至240 ℃后恒温保持30 min，以20 ℃/min升温至250 ℃，恒温10 min。载气为氮气，采用分流方式进样，检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度270 ℃，进样口温度270 ℃。

1.3.3 石榴籽油皂化反应

用80 mL水溶解24 g NaOH和0.5 g乙二胺四乙酸二钠，在溶液中加入80 mL无水乙醇得到NaOH溶液[23]。取25 g石榴籽油，加入NaOH溶液80 mL，40 ℃条件下磁搅拌40 min，加入20 mL水和90 mL正己烷，继续搅拌80 min，除去不皂化物的上层，下层加入40 mL水，加入12 mol/L盐酸调节pH 1，反应片刻分层后用分液漏斗除去下层，用无水硫酸镁干燥上层溶液后置于旋转蒸发器中旋转蒸发除去溶剂得到脂肪酸。

1.3.4 脂肪酸结晶单因素试验与响应面试验

以结晶溶剂、结晶时间、结晶温度和料液比为试验因子，根据雍梁敏等[22]采用冷冻结晶法分离橡胶籽油中多不饱和脂肪酸及Ju等[23]对高纯度γ-亚麻酸研究，采用正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）作为结晶溶剂。选用结晶时间24 h、结晶温度-20℃，料液比1∶6（g/mL），探究正己烷、丙酮、乙腈、丙酮+乙腈（2∶1）中最佳结晶溶剂；结晶时间24 h，料液比1∶6（g/mL），用丙酮+乙腈（2∶1）溶解条件下，探究-80，-60，-40，-20和0 ℃中的最佳温度；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，结晶温度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），探究12，18，24，30和36 h中的最佳结晶时间；丙酮+乙腈（2∶1）溶解，结晶温度-20 ℃，结晶时间24 h，探究1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8（g/mL）中的最佳料液比，以回收率和石榴酸纯度为考察指标，每组试验做3个平行组。石榴酸纯度以石榴酸占石榴籽油总脂肪酸百分含量计算。

用Design-Expert.V 8.0.6.1软件设计响应面试验。以结晶温度、料液比和结晶时间为因素，回收率、石榴酸纯度为响应值进行响应面优化试验，试验安排见表1。

表1 响应面试验因素水平编码值表

1.3.5 重结晶试验

在最佳工艺条件下，按照试验方法一次结晶后，将分离得到的晶体二次溶解进行重结晶，进行同样分析。

1.4 数据处理

试验重复3次，结果取3次平均值，数据采用Origin Pro 9.1 32Bit分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 溶剂种类对脂肪酸结晶的影响

不同溶剂溶解结晶试验结果如图1所示。以丙酮为溶剂时回收率和不饱和脂肪酸纯度最低，且丙酮为溶剂时结晶回收较困难，极易溶解，而丙酮乙腈（2∶1）混合时回收率和纯度效果明显提高，可能是因为乙腈凝固点高于丙酮，低温下，乙腈会凝固，更有利于溶液中脂肪酸结晶。正己烷的石榴酸纯度虽然很高，但回收率很低，使用乙腈时结晶效果次于乙腈丙酮混合溶液，因此最理想的结晶溶剂为乙腈丙酮（2∶1）混合溶液。

2.1.2 温度对脂肪酸结晶的影响

图1 溶剂种类对结晶的影响

不同温度对脂肪酸结晶影响结果如图2所示。随着结晶温度升高，脂肪酸结晶回收率逐渐下降，石榴酸纯度先升高后下降，可能由于温度急剧降低，结晶中会包含母液，影响回收晶体质量，过低温度下，体系中会形成很多晶核，且易形成细软不稳定的晶体，使整个体系粘度增加，妨碍分子移动，从而影响结晶效果[24]。温度-20 ℃时，石榴酸纯度达到90.5%，温度继续升高，0 ℃时，结晶效果急剧下降，因为较高温度下，脂肪酸的溶解度较高，难以结晶。因此，在试验结晶温度范围内，考虑耗能因素，选择最佳结晶温度为-20 ℃。

图2 温度对脂肪酸结晶的影响

2.1.3 时间对脂肪酸结晶的影响

不同时间对脂肪酸结晶影响结果如图3所示。随着时间增加，石榴酸纯度逐渐增加，24 h达到89.6%，时间继续延长，石榴酸纯度反而下降，可能是随着时间延长，体系中其他脂肪酸结晶含量增加，导致石榴酸含量下降；随着时间延长，脂肪酸结晶回收率不断增加，考虑结晶时间过长，会增加其他脂肪酸结晶，而且长时间处于低温下，会导致体系黏度增大，会有更多的滤液夹带在晶体中，影响晶体实际质量[25]，因此最佳结晶时间选取24 h。

图3 时间对脂肪酸结晶的影响

2.1.4 料液比对脂肪酸结晶的影响

由图4可知，随着料液比增加，石榴酸纯度先增加后减少，但是变化幅度不大；随着料液比增加，回收率下降，可能是因为随着料液比增加，结晶温度要求相应降低[26]，考虑溶剂回收和温度要求，选择最佳料液比为1∶6（g/mL）。

图4 料液比对脂肪酸结晶的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果

响应面Box-Behnken试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验结果与分析

利用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对试验数据进行拟合，得到三元二次回归方程：R1=89.14-26.12A-8.58B+11.56C+2.16AB-2.11AC+4.23BC-30.27A2-14.72B2-10.45C2；R2=93.91-13.22A+0.61B+2.08C+1.12AB-1.17AC-2.89BC-16.39A2-2.89B2-5.12C2。

对模型进行显著性方差分析，分析结果见表3。方程一次项A（结晶温度）、B（料液比）和C（结晶时间）对响应值R1（回收率）的影响均为极显著，A、C对R2（石榴酸纯度）的影响为极显著，各因素对R1、R2影响程度的主次顺序均为A＞C＞B，其中结晶温度影响最大。

回归方程二次项A2、B2、C2，对响应值R1、R2的影响均为极显著（p＜0.01）；交互项AB、AC、BC对R1的影响均为极显著（p＜0.01），交互项BC对R1、R2的影响均为极显著（p＜0.01），而交互项AB、AC对R1、R2的影响为显著（p＜0.05）。2个回归方程模型失拟项p值均大于0.05，即失拟不显著，表明方程拟合度好，误差小，可根据该方程对不同处理条件下的结晶回收率和石榴酸纯度进行分析和预测；CV1=1.65%，CV2=0.80%，变异系数值越小，表明方程越可靠。所以，回归方程模型能够较好反映各因素与响应值之间的关系，利用回归方程可以得到优化结晶回收率和石榴酸纯度的最优工艺条件。

表3 响应面试验方差分析

2.2.2 各因素交互作用及预测结果验证

根据响应面优化设计得到多元回归方程，分别建立各试验因素与结晶回收率和石榴酸纯度的三维曲面图，确定最佳工艺，如图5和图6所示。

由图5可知，料液比、结晶温度及结晶时间的交互作用对结晶回收率的影响极显著（p＜0.01）图中曲面陡峭。由图6可知，料液比和结晶温度及结晶时间和结晶温度的交互作用对石榴酸纯度的影响为极显著（p＜0.01），曲面陡峭，而料液比与结晶温度的交互作用对石榴酸纯度的影响显著（p＜0.05），曲面比较陡峭，这与表3方差分析结果一致。

通过回归模型分析，以结晶回收率为响应值的最佳工艺条件为结晶温度-18.06 ℃，料液比1∶5.62（g/mL），结晶时间26.2 h，在此工艺条件下，模型预测结晶回收率89.8%。以石榴酸纯度为响应值的最佳工艺条件为：结晶温度-18.04 ℃、料液比1∶5.56（g/mL）、结晶时间26.2 h，在此工艺条件下，模型预测石榴酸纯度92.5%。综合考虑优化结果，结合实际操作条件，选择结晶温度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL），结晶时间26 h，在此条件下进行3次验证试验，得到结晶回收率90.3%，石榴酸纯度93.7%。

图5 各试验因素交互作用对结晶回收率影响的响应面及等高线

图6 各试验因素交互作用对石榴酸纯度的响应面及等高线

2.3 重结晶试验结果

在响应优化的最佳条件下进行3组平行试验，一次结晶的基础上将得到的结晶在最佳工艺条件下再次溶于新的溶剂中进行二次结晶，结果取3组试验平均值。石榴酸纯度由92.7%提高到97.2%。

2.4 纯化前后石榴籽油中脂肪酸相对含量变化

为了解纯化前后石榴籽油中脂肪酸相对含量的变化，通过气相色谱分析得纯化前后脂肪酸色谱图，结果如图7所示，纯化石榴酸百分含量72.9%，经过纯化后提高到97.2%。经2步纯化后石榴籽油中大部分饱和脂肪酸被除去，石榴酸纯度显著提高。

图7 石榴籽油纯化前和纯化后气相色谱图

3 结论

以低温溶剂结晶法对石榴酸的分离纯化工艺进行优化，以期制备高纯度石榴酸。低温结晶法能有效分离纯化石榴酸等共轭多不饱和脂肪酸，低温结晶分离石榴酸最佳工艺条件为溶剂为丙酮和乙腈2∶1混合溶液，结晶时间26 h，结晶温度-20 ℃，料液比1∶6（g/mL）。最佳工艺条件下，得到结晶回收率90.3%，石榴酸纯度93.7%，通过二次结晶可将石榴酸纯度提高到97.3%。低温溶剂结晶法生产设备简单，成本较低，低温下避免石榴酸等共轭多不饱和脂肪酸发生氧化，可作为制备高纯度石榴酸的有效方法。试验结果为进一步探究石榴酸生理功能及把石榴酸作为功能因子推广应用奠定基础。