超声波-微波联合提取绿芦笋中水溶性粗多糖的工艺优化

时间：2024-05-23

崔守富，邵家威，郝征红，王春云，赵德川，岳凤丽*

山东农业工程学院食品科学与工程学院（济南 250100）

绿芦笋原产于欧洲，又称石刁柏，属百合科天门冬属草本植物[1]。绿芦笋被称为“蔬菜之王”，笋茎中包含大量人类不可缺少的氨基酸和维生素等物质[2-3]，还含有芦笋多糖[4]、黄酮[5]、皂苷[6]等生物活性物质[7]。

超声波-微波协同法主要是利用超声化提供能量使其产生空化效应，提高分子的运动频率和速度，增加溶剂的穿透力[8]；同时，微波具有便于控制、安全环保、加热迅速、高效节能的特点[9]。通过二者有效地结合，能缩短成分溶出时间、节省提取成本，显著提高提取成分的提取得率。目前，对于利用超声波-微波协同提取绿芦笋多糖的研究较少。主要研究采用超声波微波联合提取方式，通过响应面法对绿芦笋中水溶性粗多糖的提取参数进行优化组合，确定芦笋多糖提取的最佳提取工艺参数，为绿芦笋水溶性粗多糖的加工应用提供研究借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿芦笋老茎：产自福建漳州。无水乙醇、无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

WZJ-6J振动式药物超微粉碎机，济南倍力粉技术工程有限公司；GL-16M冷冻高速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司；XO-SM200超声波微波组合反应系统，南京先欧仪器制造有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计，上海精天电子仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱，上海博涵实业有限公司设备厂；XMTO电热恒温水浴锅，广东施仪仪表公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将新鲜绿芦笋老茎清洗后，切分小块于50 ℃下烘干至水分含量约为5%。利用振动式超微粉碎机粉碎至250目，将芦笋超微粉再次放入烘干箱中干燥2 h，置于密封保鲜袋备用。

1.3.2 绘制葡萄糖标准曲线

由于多糖和浓硫酸发生水解反应，生成单糖脱水生成糠醛，糠醛能与苯酚反应生成橙红色物质，故采用硫酸-苯酚法测定多糖含量。依次取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 0.1 mg/mL C6H12O6标准溶液于比色管后，补加蒸馏水至1 mL，然后按照顺序依次加入1 mL 6%苯酚溶液、5 mL浓H2SO4后摇匀，静置2 min，沸水反应15 min取出，冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标、葡萄糖含量（mg）为横坐标，作回归分析，得回归方程：y=8.322 9x-0.009 5，R2=0.997 3。

1.3.3 芦笋多糖的提取

准确称取绿芦笋老茎超微粉于超声波-微波联用提取皿中，以水作为提取溶剂，进行超声波-微波联合提取。提取后在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液20 mL加入4倍无水乙醇，置于4 ℃条件下醇沉12 h。醇沉后离心（11 000 r/min、4 ℃、10 min）取沉淀，加水复溶，即得芦笋粗多糖溶液。

1.3.4 多糖含量测定

将0.5 mL芦笋多糖提取液加入到比色管中，再依次加入0.5 mL蒸馏水、5 mL浓H2SO4、1 mL 6%苯酚，摇匀后沸水浴15 min，取出迅速冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。将其代入标准曲线，计算芦笋粗多糖的得率。

式中：Q为多糖得率，%；X为多糖溶液的质量浓度，mg；M为样品干质量，mg；K为定容体积，mL；N为稀释倍数；H为样品体积，mL；Z为定容用提取液体积，mL。

1.3.5 芦笋多糖提取单因素试验

1) 液料比对芦笋粗多糖得率的影响。选取液料比25∶1，30∶1，35∶1，40∶1和45∶1（mL/g），在超声功率750 W、微波功率800 W、超声时间20 min、温度为65 ℃条件下，研究液料比对芦笋粗多糖得率的影响。

2) 超声功率对芦笋粗多糖得率的影响。分别选用超声功率750，800，850，900和950 W，在液料比30∶1（mL/g）、微波功率800 W、超声时间20 min、温度为65 ℃的条件下，研究超声功率对芦笋粗多糖得率的影响。

3) 超声时间对芦笋粗多糖得率的影响。选用超声时间10，15，20，25和30 min，在超声功率750 W、微波功率800 W、液料比30∶1（mL/g）、温度为65 ℃的条件下，研究超声时间对芦笋粗多糖得率的影响。

4) 提取温度对芦笋粗多糖得率的影响。选取提取温度55，65，75，85和95 ℃，在超声功率750 W、微波功率800 W、液料比30∶1（mL/g）、超声时间20 min的条件下，研究提取温度对芦笋粗多糖得率的影响。

5) 微波功率对芦笋粗多糖得率的影响。分别选用微波功率700，750，800，850和900 W，在超声功率750 W、提取温度65 ℃、液料比30∶1（mL/g）、超声时间20 min的条件下，研究超声时间对芦笋粗多糖得率的影响。

1.3.6 响应面设计

在单因素试验的基础上，选取超声功率、液料比、超声时间、提取温度、微波功率为考察因素，以芦笋粗多糖得率为响应值，进行Box-Behnken的中心组合设计，见表1。通过Design Expert软件进行数据分析和试验设计，优化芦笋粗多糖在超声波-微波协同提取下的工艺条件。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 液料比对芦笋粗多糖得率的影响

液料比对芦笋粗多糖得率的影响见图1。

如图1所示，明显得出，液料比对多糖得率的影响较大，呈现先上升再略微下降的趋势。液料比40∶1（mL/g）时得率达到峰值为3.50%。液料比在25∶1～40∶1（mL/g）时，随着液料比的增加，多糖提取率逐渐升高。在液料比大于40∶1（mL/g）以后粗多糖得率下降，可能是提取剂与物料的比值增大浓度差也随之增大，从而影响超声波的空化效应令其得率下降[10]。因此，超声波微波联合提取时液料比的最佳条件是40∶1（mL/g）。

图1 液料比对芦笋粗多糖得率的影响

2.1.2 超声功率对芦笋粗多糖得率的影响

超声功率对芦笋粗多糖得率的影响见图2。

如图2所示，随着超声功率的不断提高，绿芦笋水溶性多糖的提取得率持续升高；在超声波功率达到900 W时，多糖得率达到最高值为3.41%；在超声功率达到950 W时，多糖得率达到3.39%，与超声功率达到900 W时相差不大，仅仅减少了0.02%。在超声波功率在750 W时，为绿芦笋水溶性粗多糖的最低值为2.82%。由图可知，最低值与最高值差距明显，达到0.59%，故超声波功率是影响多糖得率的显著因素。基于节约能源和环保的理念，确定为在超声功率为900 W时，为超声波微波联合提取的最佳工艺条件。

2.1.3 超声时间对芦笋粗多糖得率的影响

超声时间对芦笋粗多糖得率的影响见图3。

如图3所示，在25 min以内，水溶性粗多糖的得率随着超声时间的延长而逐渐增大；在25 min以后，多糖得率逐渐有下降的趋势。超声时间为30 min时，水溶性粗多糖得率达到2.68%，下降了0.15%。因此，确定最佳时间为25 min。

图2 超声功率对芦笋粗多糖得率的影响

图3 超声时间对芦笋粗多糖得率的影响

2.1.4 提取温度对芦笋粗多糖得率的影响

提取温度对芦笋粗多糖得率的影响见图4。

如图4所示，在提取温度从55 ℃逐渐增大到85 ℃时，水溶性粗多糖的得率随着提取温度的升高而逐渐提高；在提取温度达到85 ℃时，绿芦笋中水溶性粗多糖得率达到最大值，为2.85%。在提取温度大于85 ℃时，多糖得率逐渐有下降的趋势。因此，在提取温度为85 ℃时，超声波-微波联合提取效率最高。由单因素温度的试验结果表明芦笋粗多糖得率的最大值与最小值相差较小，差值仅为0.242%，所以后续试验舍弃单因素温度变量，将温度设为85 ℃作为可知条件。

图4 提取温度对芦笋粗多糖得率的影响

2.1.5 微波功率对芦笋粗多糖得率的影响

微波功率对芦笋粗多糖得率的影响见图5。

如图5所示，在微波功率为700～800 W时，绿芦笋中水溶性粗多糖得率随着微波功率的不断提高而上升，在微波功率达到800 W时，绿芦笋中水溶性粗多糖得率达到最大，为2.815%。在超声功率进一步上升的过程中芦笋中水溶性粗多糖的得率基本无太大变化，稳定在2.8%左右。但是当微波功率超过800 W，进一步增大时，原料中的多糖已经被充分提取出来，多糖得率不会继续升高，但与最大值基本保持平行。

图5 微波功率对芦笋粗多糖得率的影响

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面结果

试验研究超声功率、微波功率、液料比、超声时间，4个单一因素对绿芦笋水溶性粗多糖得率的影响，通过Box-Behnken试验设计出29个试验，5个中心点重复试验用来预测试验的误差，试验设计与结果见表2。

对表2数据进行回归分析，见表3。

利用Design-Expert软件分析数据，超声功率、微波功率、液料比、超声时间与芦笋多糖得率之间的二次回归方程为：Y=4.26+0.12A+0.62B+0.021C+0.031D+0.030AB-0.018AC-0.28AD-0.043BC-0.042BD-0.25CD-0.28A2-0.35B2-0.40C2-0.12D2。通过表2分析可知，回归模型极显著（p＜0.001），失拟项不显著（p＞0.1），说明回归模型与实际情况拟合吻合度较高，试验产生的误差较小，可以使用此模型对绿芦笋老茎中多糖提取得率进行模拟分析和预测；在此模型中A，A2，B2，C2都显著差异（p＜0.000 1），即超声功率、超声功率二次方项、微波功率二次方项、液料比二次方项对多糖得率具有显著影响。

2.2.2 响应面交互作用分析

根据实际试验测量数据由软件得到图6。

通过响应面垂直曲面的陡峭程度可以直观反应因素之间交互作用对芦笋多糖提取得率的影响，等高线的等高差额可以反映各因素之间交互作用的强弱。根据图6分析，根据陡峭程度从高到低程度为超声功率＞液料比＞微波功率＞超声时间，因此，各因素对芦笋多糖提取得率影响顺序为超声功率＞液料比＞微波功率＞超声时间。以上分析皆同试验模型方差分析结论相吻合。

表2 响应面分析设计及结果

表3 回归方程系数及显著性检测

图6 各因素两两交互影响响应曲面

2.2.3 芦笋水溶性粗多糖提取工艺条件的确定与验证

为了进一步改进芦笋水溶性粗多糖的提取最佳试验条件，利用Design Expert软件设计结果芦笋水溶性的粗多糖提取的最优试验参数为：超声波功率936.23 W、液料比41.60∶1（mL/g）、微波功率807.96 W、超声时间20 min。在这个最优条件下，绿芦笋水溶性粗多糖的得率的预测值为4.30%。由于考虑到试验仪器的超声波功率和微波功率设置的精准度，将最优参数条件设定为超声功率936 W（仪器最大功率的78%）、液料比42∶1（mL/g）、微波功率804 W（仪器最大功率的67%）、超声时间20 min，该条件测得的绿芦笋水溶性粗多糖的得率是4.23%。说明该模型对芦笋多糖提取条件拟合较好，得到的优化条件可行。