某猪场PCV2、PRRSV和附红细胞体多重感染的诊断

王招弟，吴好叶，严莉娅，姜玉瑶，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

某猪场PCV2、PRRSV和附红细胞体多重感染的诊断

王招弟，吴好叶，严莉娅，姜玉瑶，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

2017年4月以来，贵州某猪场的保育猪陆续开始发病，发病率约为30%，病死率约16%。据述该猪场发病猪主要症状为高烧（41 ℃以上）、气喘和腹泻等，将送检发病猪解剖后发现其组织器官中淋巴结肿大、出血、肾脏有囊肿及黄染现象，白斑肾特征明显，肺脏出血间质性肺炎特征明显，脾脏有瘀血梗死现象，其他脏器未见明显眼观病变。为了对其进行确诊，本实验室对上述送检病料进行了实验室检测，结果显示该猪场发病猪存在猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和附红细胞体的多重感染。

1 材料

1.1 病料

系分别采自2头发病仔猪的组织病料（肝、肾、肺、淋巴结和脾脏等脏器）。

1.2 主要试剂

TaKaRa MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.4.0、Prime-Script One Step PT-PCR Kit VER.2.0、DL2000皆购自大连宝生物公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 病料的处理及核酸的提取

对送检样品进行剖检，如图1所示。分别取适量剖检病猪的肝、肾、肺脏、淋巴结和脾脏进行碾磨匀浆，反复冻融3次后，12 000 r/min离心10 min，取上清，用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒进行核酸的提取。

图1 解剖病例观察结果

2.2 附红细胞体检测

采集送检2头发病猪血液，分别涂片、处理后，于400倍镜下观察。

2.3 病原核酸检测

分别用本实验室设计的PCV2(上游引物：5’－TCGGAATT C A T G T C T A A C G G T T C T－3’，下游引物为：5’-ACGCTCGAGTTAGACTAAATGAAG－3’。)和PRRSV（上游引物：5′-CCCAAGCTTCCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTT-3′，下游引物：5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′）的特异性引物，以提取的核酸为模板，参照一步法RT-PCR试剂盒说明书，对PCV2、PRRSV进行核酸检测，其反应总体系为50μL：2×1 StepBuffer 25μL，模板7.0μL，上下游引物各1.0μL，Prime-Script 1 Step Enzyme Mix 2μL， RNase Free H2O 14μL；参照PCR试剂盒说明书，对PCV2和PRRSV进行核酸检测，其反应总体系为50μL：ddH2O 10μL，2×GC BufferⅠ25μL，dNTP 8.0μL，上下游引物各2.0μL，模板2μL，Taq酶1μL。上述反应程序均为：50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3 病原检测结果

3.1 附红细胞体检测

将送检的两份血液分别涂片、处理后，于400倍镜下观察，发现a管血红细胞表面及血浆中有游动的各种形态的附红小体，红细胞呈星形或不规则的多边形；b管血红细胞正常，未见有附红细胞体，如图2。

3.2 组织样品的病原检测

根据检测要求，提取混合组织中核酸，应用一步法RT-PCR试剂盒，对PRRSV和PCV2进行检测。检测结果显示，混合组织中PCV2和PRRSV呈阳性，结果见图3。

图2 送检血液样附红细胞体检测结果（400倍镜下）

图3 送检样本病原检测结果

4 结果分析及建议

病原检测结果表明，送检病猪混合组织中PCV2和PRRSV均呈阳性，其中一份血液样品存在附红细胞体感染。由于PRRSV、PCV2常常导致严重的免疫抑制从而继发其他病原感染，影响生长性能，且急性PRRS常引起猪群大规模死亡。通过临床发病情况及组织病理特征可知，猪群系因免疫猪瘟疫苗引起应激，进而诱发猪蓝耳病疫情，其中猪圆环病毒和猪蓝耳病毒在免疫猪瘟疫苗前应该已经潜伏感染猪群，并使猪群处于多系统衰竭的亚临床病症；同时部分发病猪还诱发附红细胞体感染，使本次疫情更加复杂。故建议结合猪场实际情况，加强PRRSV和PCV2的疫苗免疫及日常保健预防；对于猪附红细胞体病，应加强饲养管理，保持猪舍、饲养用具卫生，减少不良应激等是防止该病发生的关键，夏秋季节要经常喷洒杀虫药物，防止昆虫叮咬猪群，切断传染源，在实施诸如预防注射、断尾、打耳号、阉割等饲养管理程序时，均应更换器械、严格消毒，购入猪只亦可进行血液检查，防止引入病猪或隐性感染猪。

2017-05-24）

贵州大学SRT项目, 贵大SRT字(2015)093号

王招弟（1993—），女，在读学士，研究方向：动物传染病病原分子生物学。E-mail: 1458316517@qq.com

*通讯作者： 曾智勇（1978—），男，教授，博士，硕士生导师，从事动物传染病病原分子生物学研究。E-mail:zyzeng@gzu.edu.cn