猪精液冷冻和解冻技术

杨 露，张全生，邓泽涛

（重庆市种畜场，重庆 400020）

精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新，自冷冻精液在牛开始试验成功以来，迄今已40多年，利用冷冻精液解冻后进行输精已成为许多国家作为人工授精的主要方法。目前，有些国家的精液冷冻技术发展到崭新的工厂化阶段。牛的冷冻精液在生产中得到了大力推广和应用。而猪的冷冻精液至今仍处于实验阶段，究其主要原因是解冻后精子复苏率较低，异常精子多，受胎率低于正常水平。

1 精液的冷冻

1.1 冷冻的原则

冷冻过程中的精细胞不但要对保存温度（-196 ℃）有耐受能力，而且要能经受从射精时肌体体温到保存时超低温度的变化，且活率不能过度降低。因此，后者比前者显得更重要，每种细胞都有它理想的冷冻与解冻速度。第一，冷冻速率太慢时，与冷冻保护剂接触时间过长，精子容易受冷冻保护剂的化学损伤作用而死亡或遭受破坏。第二，冷冻速率过快时，细胞内液体易导致结冰现象，对细胞造成物理或化学伤害。解冻原理恰好相反。

表1 猪精液常用冷冻剂稀释液成分表

1.2 稀释液的配制原则

第一，配制稀释液所使用的一切用具，必须经认真清洗和严格消毒。第二，稀释液要现用现配，保持新鲜，经密封、消毒的稀释液，允许在0～5 ℃的冰箱中保存1周。但卵黄、抗生素、酶、激素等有生物活性的物质必须在用前时临时添加。第三，稀释用水应为蒸馏水或重蒸馏水，要求保持新鲜、中性。 第四，配制稀释液所用的化学制剂要纯净，一般要求化学纯或分析纯；称量要准确无误，经充分溶解、过滤后进行消毒（隔水煮沸或蒸气消毒）。第五，卵黄和奶类成分要求新鲜、无污染、无杂质。第六，抗生素等有生物活性的物质，必须在稀释液冷却至室温时按计量准确加入，以免失去活性和对精子造成不良影响。

1.3 冻精颗粒的制备

用手握法采精，开始射出的清亮液体部分应弃去，这部分液体是尿道球腺的分泌物，不含精子，用来冲洗尿生殖道的积尿。因此，开始射出的20 mL液体不应接取。当射出乳白色液体时，即为浓精液，要用集精杯收集起来。对于采集的精液，经纱布过滤后，对鲜精进行品质检测,选择活率达80%以上,精子密度在2.0亿～3.0亿个/mL以上的精液用于冷冻。

为保护精子和减少冻害作用，在冷冻前应当用冷冻稀释液对精液进行稀释。常用的稀释法有一次稀释法、二次稀释法。一次稀释法是将采出的精液和含甘油（甘油作用是增强精子抗冻能力，但浓度过高对精子有毒害作用）的同温稀释液按比例要求一次性添加；二次稀释法是将采出的精液先被不含甘油的第一稀释液稀释后再用含甘油的第二稀释液做二次稀释，以减少甘油对猪精子的有害作用。

以二次稀释法为例：将采集的精液在常温的等温条件下，用不含甘油的成分的第一稀释液（见表1），根据精液品质按比例稀释。稀释后的精液先缓慢降温（用纱布包裹）至15 ℃维持4 h，再从15 ℃经1 h降至5 ℃，然后用等温的含甘油的成分第二稀释液（见表1）进行稀释。稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。利用广口液氮罐，以聚四氟乙烯板作为冷冻面，要使承接精液的表面与液氮面保持一定的距离（1～2 cm）。在滴冻的过程中，要维持-80～-100 ℃的温度。滴冻前要将经平衡的精液充分混匀。并检查精子的活率。 滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻时间控制在60 s内完成，加盖熏蒸平衡3～4 min后待所有颗粒已冻结，经抽样检查（一般随机抽取2粒），解冻活率在0.3以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。

2 精液的贮存

猪的冷冻精液是以液氮做冷源进行贮存的，需要时可随时取出。液氮是空气中的氮气经压缩、分离形成的一种无色无味无毒的液体,沸点温度为-195.8 ℃。在常温下,液氮沸腾,吸收空气中的水气形成白雾。液氮具有很强的挥发性,当温度升至18 ℃时,其体积可以膨胀680倍。此外,液氮是一种不活泼的液体,渗透性差,无杀菌能力,但是在-196 ℃的超低温可使多数细菌和病毒停止繁殖。为防止温度变化对精液品质的影响，取放动作要迅速，尽量减少在空气中停留的时间。从贮存容器中提取冷冻精液时，精液不应超过液氮容器的颈基部，避免因温度的回升造成精液解冻活率的下降。

3 精液的解冻

3.1 解冻原理

冻精的解冻过程同冷冻过程一样，必须通过精子冰晶化的危险温度区，才不致于对精子细胞造成损伤。实验证明，解冻速率比冷冻速率对精子质量的影响更大（Eriksson等，2000）。因此，解冻速率是影响精子质量及存活的一个重要因素。而影响解冻速率的关键是解冻温度的控制。

3.2 解冻方式及步骤

3.2.1 解冻方式

冷冻精液的解冻温度，有低温冰水解冻（0～5 ℃）、温水解冻（30～40 ℃）、高温解冻（50～70 ℃）几种。实践中，猪的精液解冻温度以50～60 ℃效果较好。以干解冻为例，将灭菌试管置于50～60 ℃水中恒温后，投入若干精液颗粒（一般是一个输精剂量），摇动至融化，同时加入1 mL 20～30 ℃解冻液（5 g葡萄糖、0.3 g二水柠檬酸钠、0.1 g乙二胺四乙酸钠，100 mL蒸馏水）进行解冻。

3.2.2 精子活率及其形态观察

解冻后，立即取1～2滴精液滴在事先预热的载玻片上，置于显微镜下37 ℃恒温载物台上，测定活率,活力在0.3以上者才能用于输精。在实践生产中，由于操作等多方面原因，经过冷冻和解冻处理后的精液品质往往不理想，为了鉴定稀释液和精液处理后的效果，保证较好的受精率，在测定精子活率的同时还要参考以下几个指数。

1）精子存活时间和存活指数的检查：将精液注入盛有1 mL质量分数2.9%柠檬酸钠溶液的试管中，放入37 ℃恒温水箱内记录精子存活时间。开始每隔1 h观测1次活率，当精子活率降低一半时，间隔30 min观测1次活率，直到精子全部死亡，记录精子存活时间。精子存活时间越长，指数越大，说明精子生活能力越强，品质越好。

2）精子畸形率检查：精子畸形主要为头部畸形 (长形头、梨形头、巨形头等)和尾部畸形(尾部卷曲、弯曲)。可将精液滴制成抹片直接在600倍以上显微镜下观察，每个切片记数200个精子，计算出畸形精子百分率即为精子畸形率。品质优良的猪精液畸形率不超过18%。

3）精子顶体异常率：精子顶体异常有膨胀、缺损、部分脱落、全部脱落等数种。可将解冻后的精液滴于载玻片上，用蓝墨水染色法染色，在1 000倍油镜下观察精子形态，观察200个以上精子中顶体异常数，计算出顶体异常率。正常情况下，猪顶体异常率平均为2.3%，如果超过4.3%，将会直接影响受精率。

4 存在的问题和应用前景

猪精液冷冻和解冻技术目前还不成熟，一方面是由于与之配套的猪精液冷冻过程中的冷冻-解冻机理、精子损伤机理、精子内部组成物质的变化规律及分子机制等诸多方面尚不完全清楚；另一方面实际操作过程中也存在同一种公猪不同时期精液品质存在差异，并且稀释液添加量的不同、解冻人员操作规范上存在的差异性等都会在一定程度上影响猪精液的品质。但是猪精液冷冻的研究具有重要研究意义，应用前景广泛。从理论上通过筛选适宜的猪冻精颗粒的解冻温度，可以明显提高精子的冻后复苏率、活率及解冻后精子的受精能力。该研究在建立优良品种猪的种质资源，保存品种种质资源具有不可替代的作用，在生产实践中对优良种猪精液的储运和实际使用效果以及生产性能的发挥也会具有十分显著的促进作用。