陈皮对植物乳杆菌增殖培养条件的优化

范寰+孟繁瑞+李秀丽+任卫科+池晶晶+李富强+田向学+王建国+王文杰

摘 要：以陈皮作为协同剂，采用L16（45）正交试验优化其对植物乳杆菌的增殖培养条件，结果表明，筛选出的最佳培养条件为培养温度35 ℃，培养时间30 h，接种量为1%（V/V），培养基初始pH值为8，陈皮的添加量为80 g·L-1，在此条件下培养，活菌数为1.86×1010 cfu·mL-1。

关键词：陈皮；植物乳杆菌；增殖

中图分类号：R284 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.010

植物乳杆菌作为一种益生菌因其代谢产物乳酸、细菌素及蛋白酶而广泛应用于畜禽生产中，它可以维持肠道菌群平衡，促进营养物质的消化和吸收[1-2]。 为了让乳酸菌更好地发挥作用，人们开展了协同剂的研究。目前研究的主要有寡糖、中草药和氨基酸。协同剂不仅能够提高乳酸菌的生存率，延长其作用时间，使乳酸菌以更大的数量到达体内，而且能刺激肠道内源性及外源性乳酸菌的定植和生长，此外还能够增强乳酸菌的代谢活性[3]。陈皮（Pericarpium citri Reticulatae）具有理气健脾、燥湿化痰作用，在临床用于胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等症[4]。我国柑橘栽种面积居世界首位，产量位居世界第3。每年大量加工和消费柑橘的同时也产生数量惊人的桔皮（约占果质量的20%～25%）。而桔皮除少数用于制做中草药（陈皮）以及饲料外，大部分被抛弃或填埋，这不仅造成了饲料资源大量浪费，也严重污染了环境[5-6]。丁轲等[7]研究表明陈皮对乳酸杆菌的生长有促进作用。

因此，本研究拟对陈皮作为一种协同剂，优化其对植物乳杆菌体外增殖培养条件，为开发一种中草药和益生菌合生元提供生产技术参数。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），天津市畜牧兽医研究所饲料微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基 MRS液体培养基： 蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸氢二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸钠2 g，吐温80 1 g，磷酸氢二钾2 g，七水硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 000 mL。

MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，柠檬酸氢二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸钠2 g，吐温80 1 g，磷酸氢二钾2 g，七水硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 发酵条件 设计了L16（45）五个因素分别是温度、时间、接种量、pH值和陈皮添加量的四水平正交试验（表1）。

按正交试验设计表称取陈皮放入三角瓶中，加入MRS液体培养基至100 mL，混匀后调节pH值， 121 ℃ 20 min灭菌后分别按不同的接种量加入植物乳杆菌，进行不同发酵温度和培养时间的发酵培养。

1.2.2 计数方法 在1.5 mL离心管中加入900 μL无菌水，加入100 μL样品，分别稀释至10-5、10-6、10-7数量级，取100 μL涂平板计数，每个稀释度3个重复，37 ℃培养3 d计数。

1.2.3 数据分析 采用正交设计助手专业版v3.1。

2 结果与分析

根据表2因素的极差数值进行比较，发现接种量的极差数值最大，说明接种量对植物乳杆菌增殖的影响在5个考察因素中是最大的，5个因素极差大小顺序依次为接种量>时间>温度>pH值>陈皮浓度， 筛选出的最佳培养条件为培养温度35 ℃，培养时间30 h，接种量为1%，培养基初始pH值为8，陈皮的添加量为80 g·L-1，在此条件下培养，活菌数可达1.86 ×1010 cfu·mL-1。

3 结论与讨论

菌体生长是一个复杂的过程，众多因素都影响着菌体的生长状况，如温度、pH值、供氧强度、底物浓度、产物浓度等[8]。

培养基pH值对微生物的生长影响，主要是其影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化及影响营养物离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收[9]。每种微生物都有一个适宜的pH值范围，而微生物细胞对pH值的改变是很敏感的，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适应范围，就会降低抑制这些微生物的生命活动[10]。研究表明，pH值过高或过低对植物乳杆菌的增殖都存在不利的影响，pH值的变化会引起植物乳杆菌体内酶发生变化，从而影响细菌的生长[11]。本研究优化后的pH值为8。

温度高低与发酵液中的菌体生长速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率密切相关，所以研究温度对菌体生长的影响非常必要[12]。微生物生长是一系列复杂化学反应的结果，而温度的改变必然影响生物体内进行的许多生化反应，菌体合成和代谢产物所依赖的各种酶都会受到温度的影响，进而影响它们的生长速率。通常，在生物学范围内每升高10 ℃，生长速度就加快一倍，当超过最适生长温度，生长速率随温度升高而降低[13]。尤其对大规模生产中研究最佳培养温度需同时考虑到工业化生产效率。本研究最佳发酵温度为35 ℃。

不同的接种量对菌体生长的影响不同，接种量大，菌体生长繁殖快，但后期由于营养缺乏，菌体衰退的也很快；接种量小，菌体前期生长慢，达到稳定期的时间相对滞后一点，但后期菌体生长良好[14]。本研究优化后的接种量为1%。

发酵时间的长短决定了发酵是否完全，时间过短，将达不到发酵的目的；时间过长，由于受其它杂菌的作用而影响发酵产品的品质。应该根据菌种特性、培养基特性、发酵目的以及工业化生产成本等综合因素来筛选最合理的发酵时间[15]。本研究最佳发酵时间为30 h。

参考文献：

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