禽噬菌体分离及效果评价

成华初，文进权，李建军，朱 玲，潘延钵

（1.常德市鼎城区农业农村局，湖南 常德 415101；2.常德市鼎城区中河口镇农业综合站，湖南 常德 415121；3.常德市鼎城区尧天坪镇农业综合服务中心，湖南 常德 415129；4.湖南瑞阳瑞泰生物科技有限公司，湖南 常德 415106）

禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌所引起的局灶性和全身性感染的疾病[1]；禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属中的任何一个或多个成员所引起的禽类的急性或慢性疾病的总称[2]，是可以引起局部或全身感染和慢性无症状携带者状态的兼性胞内病原体[3]。这两种病的发生均能引起蛋鸡产软壳蛋、沙壳蛋、糊肛甚至死亡。随着近年来畜禽业的快速发展与推广，致病性大肠杆菌与沙门氏菌给动物养殖业带来的损失越来越大。致病性大肠杆菌病具有难以治愈，死亡率高，极易复发等临床特点；而沙门氏菌则能够导致畜禽常见多发病的发生。畜禽一旦发病，大多是使用抗生素来进行防治。抗生素治疗有着几十年的有效治疗历史，但随着越来越多耐/抗药性细菌的出现，细菌对抗生素的抗药性已成为一个大问题[4]。为解决这一问题，研发出一款非抗生素类制剂已迫在眉睫。

噬菌体疗法被应用于临床抗细菌感染治疗有着100多年的历史[5]，早在20世纪30年代就有噬菌体成功治疗霍乱的报道[6]。其作为一类可以感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，具有特异性强，仅针对目标宿主菌，对周围其他菌株无影响，当目标宿主菌被杀死后衰减并被清除的抗生素所没有的优势。有研究证明噬菌体对动物和人体是安全的[7-8]，且噬菌体是一种极具潜力的抗菌剂来源[9]，将其作为一种天然绿色、安全有效的抗生素替代品，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用菌株

大肠杆菌RYE01、RYE02、RYE04、RYE07由湖南瑞阳瑞泰生物科技有限公司分离保存及供应。噬菌体RPE01P、RPE02P、RPE04P、RPE07P由湖南瑞阳瑞泰生物科技有限公司分离保存及供应。

1.1.2 主要试剂和仪器

麦康凯培养基、ss培养基、营养琼脂培养基、TSA培养基、LB肉汤培养基、TSB培养基、5%甘油。

超净工作台、恒温培养箱、恒温气浴振荡器、立式压力蒸汽灭菌锅、高速离心机、蠕动泵、超低温冰箱。

1.2 宿主菌的分离与保存

以无菌操作的方法将病死鸡肝脏样品分别划线接种于麦康凯培养基，经37℃恒温培养箱过夜培养。挑取疑似大肠杆菌/沙门氏菌菌落接种于营养琼脂/TSA培养基，37℃恒温培养箱过夜培养。挑取单个菌落于液体培养基，混合均匀，恒温气浴振荡器37℃170rpm培养至液体变浑浊。5%甘油分装2～3支ep管1ml/管，编号，-80℃超低温冰箱保存。

1.3 噬菌体的分离与保存

1.3.1 鸡场粪便污水处理

取鸡场粪便、土壤、污水样品混合均匀静置5min，纱布过滤，离心机6000rpm离心6min，留上清并重复离心3次，最终上清用注射器与0.45μm滤器过滤于烧杯备用。

1.3.2 噬菌体的分离与保存

吸取0.1ml宿主菌于3ml/管液体培养基各两支（一支为菌株组，一支为噬菌体组），恒温气浴振荡器37℃ 170rpm培养至浑浊。以无菌操作的方法用注射器与0.22μm滤器过滤0.3ml备用上清于噬菌体组，继续培养6～12h，液体变澄清即分离到噬菌体。吸取噬菌体1ml/管于2～3支ep管，编号，-80℃超低温冰箱保存。

1.4 噬菌体制剂的制备

1.4.1 菌种复苏

取出并解冻大肠杆菌RYE01、RYE02、RYE04、RYE07，噬菌体RPE01P、RPE02P、RPE04P、RPE07P。无菌条件下用接种环接种大肠杆菌于营养琼脂培养基，经37℃恒温培养箱过夜培养。挑取单个菌落于3ml/管的液体培养基，恒温气浴振荡器37℃170rpm培养至浑浊。吸取0.1ml菌液于3ml/管液体培养基各两支（一支为菌株组，一支为噬菌体组），恒温气浴振荡器37℃170rpm培养至浑浊，噬菌体组中加入经注射器与0.22μm滤器过滤的噬菌体液体，培养至液体变澄清，得到复苏后的噬菌体与大肠杆菌。

1.4.2 制备噬菌体生物制剂

吸取0.1ml菌液于100ml/瓶的液体培养基，恒温气浴振荡器37℃170rpm培养至浑浊，加对应噬菌体上清，继续培养至澄清，倒入离心管7000rpm离心8min备用。吸取0.6ml菌液于600ml/瓶的液体培养基中，恒温气浴振荡器37℃170rpm培养至浑浊，加入约50ml备用上清，继续培养至澄清。离心机7000rpm离心8min，倒上清于容器，混合均匀。无菌条件下0.22μm滤膜过滤装瓶。

1.5 噬菌体防治蛋鸡大肠杆菌沙门氏菌病临床试验

选取两栋整体情况相近的鸡舍进行实验观察，一组为实验组A 15000羽/100ml噬菌体制剂饮水投药，连用9d；另一组为对照组B正常饮水。从喂药前三天开始观察并记录鸡群整体状态（精神状态、采食量、蛋质、鸡粪情况等）并连续统计以下指标共12d。糊肛率：每组选5个采样点，每点各100只鸡，统计糊肛量与糊肛率；死淘率：统计各组死淘量与死淘率；产蛋率：统计各组产蛋量与产蛋率。

2 结果与分析

2.1 宿主菌以及噬菌体的分离与保存

从病死鸡肝脏样品中分离保存并鉴定了5株大肠杆菌，8株沙门氏菌，并从鸡场粪便、土壤、污水样品中分离并保存了每株菌相应的噬菌体，保存于湖南瑞阳瑞泰生物科技有限公司。

2.2 噬菌体生物制剂的制备

按1.4所述方法分别对各株噬菌体进行培养与制备，最终获得4.9L噬菌体制剂。

2.3 噬菌体防治蛋鸡大肠杆菌沙门氏菌病临床试验数据

通过对养殖场各栋鸡舍生产数据以及鸡群健康状况对比后，选取各项数据接近的B4与B3两栋鸡舍内鸡群进行试验分组，将B4栋鸡舍内鸡群作为实验组A（用药组），将B3栋鸡舍内鸡群作为实验组B（对照组）实验期间，其他药物均停止使用。

2.3.1 A、B两组鸡群整体状态观察

喂药前3d，两组整体精神状态与采食量一般，蛋质较差，软壳蛋、沙壳蛋较多、粪便较稀。喂药7d后两组整体精神状态与采食量一般；A组蛋质变好、软壳蛋与沙壳蛋减少、蛋壳较光滑、蛋重稍增加、鸡粪较干，较B组变化较大。喂药9d后A组较B组蛋质、鸡粪更好。

2.3.2 A、B两组采样点糊肛率统计

噬菌体制剂可以有效降低蛋鸡糊肛率。A组从投药第4d开始糊肛率明显下降，第5d开始未见糊肛；B组糊肛率基本保持在1.2%～1.4%左右，未见下降，见表1。

表1 A、B两组采样点糊肛率统计表

2.3.3 A、B两组死淘率统计

噬菌体制剂能减少蛋鸡死淘率。A组从投药第5d起死淘率较B组低，B组死淘率一直呈上下浮动状态，见表2。

表2 A、B两组死淘率统计表

2.3.4 A、B两组产蛋率统计

噬菌体制剂对提高蛋鸡产蛋率未有明显成效见表3。

表3 A、B两组产蛋率统计表

3 讨论与结论

近几年，随着养殖业的发展，细菌性的疾病给养殖业带来的损失是不可忽略的。其中鸡的致病性大肠杆菌病与沙门氏菌病几乎伴随鸡生长、繁殖、生产的一生，并严重影响和制约着我国养鸡水平的上升。对致病鸡群的防治措施不全面、不正确，仅靠大剂量的抗生素控制，导致鸡的生产及产品检测中含有大量病残、药残，影响我国鸡产品的出口及人类的身体健康。噬菌体是一种能侵袭细菌的病毒，其广泛存在于自然界中，据统计分析其数量可以达到1031[10]。早7在20世纪初，噬菌体治疗就取得了积极的治疗效果[11]。临床应用上，噬菌体的宿主范围比抗生素窄，这种有限的宿主范围对疾病的治疗非常有利。抗生素治疗通常会影响肠道菌群，但噬菌体疗法对胃肠道菌群与体内生态的影响比抗生素治疗要小得多。可见噬菌体疗法在防治细菌性疾病与代替抗生素治疗疾病方面具有广大前景。

通过对两组鸡群用药前后整体状态观察，发现本研究所制备的噬菌体生物制剂可以提高蛋质与蛋重、减少沙壳蛋与软壳蛋、改善鸡群拉稀、减少糊粪蛋、使蛋表面光滑（鸡群的整体状态观察）；在降低蛋鸡糊肛率方面具有良好的防治效果（表1）；在减少蛋鸡死亡率方面具有较好的防治效果（表2）；在提高产蛋率方面未见成效（表3）。

本实验通过从病死鸡肝脏样品中分离致病性大肠杆菌及沙门氏菌作为宿主菌，添加鸡场粪水过滤上清分离培养相应噬菌体，与本实验室之前所分离保存的较广谱噬菌体进行扩培、混合过滤来制作噬菌体制剂。通过设计蛋鸡致病性大肠杆菌沙门氏菌临床试验，验证了该噬菌体制剂能改善鸡蛋品质、减少糊肛率与死淘率，在蛋鸡致病性大肠杆菌沙门氏菌感染上具有良好防治效果。说明该款制剂能改善鸡群的肠道菌群，杀死致病性大肠杆菌及沙门氏菌，但由于鸡群体内含有别的致病菌，故导致对死淘率的改善低于糊肛率。而产蛋率未有明显变化，则可能是处于秋冬换季期。