不同种植方式对玉米内生菌的影响

滕青华

摘要：【目的】本试验通过研究玉米单作和间作对内生菌的影响，为进一步探明玉米黄草乌间作优势奠定基础。【方法】采用盆栽试验，设A为玉米间作黄草乌根部尼龙网分隔（1株玉米+1株黄草乌）、B为玉米单作根部尼龙网分隔（1株玉米+1株玉米）及C为玉米与空白根部尼龙网分隔（CK，1株玉米+空白）。【结果】玉米内生细菌和真菌，A处理分别有12属22株、11属18株，B处理分别有8属12株、9属12株，C处理（CK）分别有5属7株、5属7株，3个处理玉米根、茎、叶中，A处理分别分离出9属15株、7属12株、8属13株，B处理分离出6属10株、6属7株、5属7株，C处理分离出5属7株、3属4株、2属3株，A处理的内生细菌和真菌均比B和C处理多；其中，有益内生菌，A处理有6属9株，B处理有5属6株，C处理有2属2株；总体上，A处理内生菌数量最多、有益内生菌也最多。【结论】玉米与黄草乌间作增加了玉米内生细菌和真菌的数量。

关键词：玉米；黄草乌；间作；细菌和真菌

1 前言

植物内生菌是重要的微生物资源，根茎叶等器官和组织细胞中都存在丰富的内生菌[1]。内生菌对宿主植物抵御病害有重要的作用[2]，因此，开发植物内生菌生物防治的潜能已经成为一项研究热点，很多学者热衷于分离对玉米常见病害有防控作用的菌株[3]，为开发生物农药等研究奠定基础；内生菌还可以促进植物的养分吸收及生长，傅晓方等人从玉米植株中筛选出固氮酶活性的内生菌接种到小麦后，与未接种的比较，其小麦苗高、鲜质量、干质量等都显著提高[4]，韩晓日等人从玉米中分离出两株具有固氮能力的菌株，能够显著地促进幼苗期玉米的生长[5-6]。但我们不清楚玉米与黄草乌间作根际互作对微生物群集有什么影响。为此，本文利用玉米与黄草乌间作，开展根际互作对玉米微生物内生菌的研究，以期为更好地开发利用玉米促生菌及玉米黄草乌间作提高一定的依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试品种

玉米（Zea mays L.）：RD 26

黄草乌（Aconitum vilmorinianum Kom）：“滇草乌1号”。

2.1.2 实验试剂

酒精、PCR试剂盒、1×TAE缓冲溶液、琼脂糖、甘油、氯化钠、酵母浸粉、胰蛋白胨、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、琼脂。

2.2 试验设计

试验采用单因素设计。设：A玉米间作黄草乌根部尼龙网分隔（1株黄草乌+1株玉米，种间）、B玉米单作根部尼龙网分隔（1株玉米+1株玉米，种内）、C玉米根部与空白根部尼龙网分隔（1株玉米，CK）3个处理（见图1），每盆为1次重复，重复16次，3（处理）×16（重复）=48盆；塑料盆大小为36 cm×30 cm，采用30μm网孔的尼龙网从上口径到底部用对称分为两边，以防止两边根系相互渗透。种植区域为方形，面积为5.5m×7.8m。

2.3 田间种植及管理

玉米：玉米种子用0.5%次氯酸钠消毒10min，然后用无菌水冲洗2～3次。

黄草乌：黄草乌块根用多菌灵粉末杀菌消毒后直接种植。

土肥基质质量比例：土：蛭石：基质：锯木：有机肥=4：3：2：1：1

将经过消毒杀菌处理的玉米种子与黄草乌块根于2020年6月16日种下。在玉米与黄草乌生长的每个阶段都保证水肥充足，黄草乌对水分的需求要比玉米少，在保证水分充足的前提下，还要防止黄草乌渗水过多而造成根部腐烂，预防常见病虫害，除杂草，测量生理指标。

2.4 内生菌筛选鉴定技术

2.4.1 培养基的配制方法

Luria-Bertani固体培养基（1000ml）：琼脂15g，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

Luria-Bertani液体培养基（1000ml）：氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g。pH：7.2±0.2

马铃薯葡萄糖琼脂培养基，简称PDA（1000ml）：称取39g。pH：5.6±0.2

培养基于121℃下灭菌20min，备用。

2.4.2 样品处理

于玉米的灌漿期分别取A、B及C三处理玉米的根、茎、叶各三份，将取好的鲜材料保鲜后及时送到实验室进一步进行处理。用流动的自来水洗涤玉米的根、茎和叶，然后用无菌蒸馏水洗涤，在超净工作台中用75％的乙醇表面消毒1min，用5%次氯酸钠表面消毒5min，再用75％的乙醇表面消毒30s，最后在无菌蒸馏水中洗涤10min，总共洗3次，将最后的洗涤水铺在Luria-Bertani固体培养基上，表面消毒方法的成功是通过在培养基中未检测到微生物生长来确认的。筛选细菌的鲜材料需充分研磨，在Luria-Bertani液体培养基上充分震荡24h，得到原液备用。筛选真菌的鲜材料切成适当大小备用。

2.4.3 培养与纯化

细菌培养需取上一步得到的原液500μL，加入4500μl的无菌水依次稀释为10-2、10-3、10-4三个浓度，三个浓度分别涂布到Luria-Bertani固体培养基上，在恒温箱中培养1～3d后，根据菌落的颜色、形态、黏稠度、粗糙度等将可鉴定为不同的菌株分别接种到新的Luria-Bertani固体培养基上，反复操作，直至分离出纯化的菌株。真菌培养将切成适当大小的鲜材料直接接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在恒温箱培养2～10d，根据菌落的颜色、形态、菌丝的有无、孢子的有无等将可鉴定为不同的菌株分别接种到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，反复操作，直至分离出纯化的菌株。

2.4.4 DNA提取

细菌DNA的提取步骤为从培养基上挑取1～2mg的菌落放入2.5ml的摇菌管，加入1000μl的Luria-Bertani液体培养基震荡培养24h备用，在PCR管中加入10μL的最佳伴侣和5μL菌液，95℃水浴裂解3min后12000rpm高速离心机上离心1～3min，吸取2μL上清液作为扩增模板。真菌提取DNA步骤为从马铃薯葡萄糖琼脂培养基上取0.5～2mg菌落，加入12μl的bufferA，95℃水浴裂解10min后，在12000rpm高速离心机上离心5min，取2μL上清液作为扩增模板。

2.4.5 PCR反应体系

细菌反应体系：酶（超光速mix）10μl，两个引物1492R和27F各0.5μl，扩增模板2μl，加入dd水7μl至反应体系20μl。

真菌反应体系：T5 Plant DNA Polymerase酶12μl，扩增模板2μl，两个引物ITS1、ITS4各0.5μl，加入dd水10μl至反应体系25μl。

细菌引物序列为：

1492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’）

27 F（5’-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3’）

真菌引物序列为：

ITS1（5’-G GAAGGTAAAAGTCAAGG-3’）

ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）

反应体系加完全后，进行振荡混匀，12000rpm高速离心机上离心1min。

2.5 测定指标

生长指标：玉米株高、茎粗、叶长、叶宽、叶绿素含量、生物量、地上部分与地下部分重量。

产量指标：玉米穗长、穗粗以及籽粒干重。

3 结果与分析

3.1 玉米不同种植方式对其内生细菌的影响

不同处理情况下玉米根内生细菌数量统计结果显示，A处理根内生细菌数最多，共有7株，属于碱杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、泛菌属及寡养单胞菌属5个属；B处理共有4株，属于寡养单胞菌属、不动杆菌属及芽孢杆菌属3个属；C处理（CK）共4株，属于寡养单胞菌属、不动杆菌属及肠杆菌属3个属。说明玉米间作黄草乌使玉米根内生细菌增多。

不同处理玉米茎内生细菌数量统计显示，A处理共6株，属于自沙门氏菌属、肠杆菌属及芽孢杆菌属3个属；B处理共3株，属于肠杆菌属等两个2属；C处理（CK）共1株，属于肠杆菌属。说明单株种植使玉米茎内生细菌种类减少，玉米间作黄草乌使玉米茎内生细菌种类增多。

不同处理玉米叶内生细菌数量统计显示，A处理共9株，属于芽孢杆菌属、勒克氏菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、寡养单胞菌属5个属；B处理共5株，属于肠杆菌属、假单胞菌属及放射毛霉属3个属；C处理（CK）共2株，属于副球菌属。说明玉米单作减少了玉米叶内生细菌的种类，玉米间作黄草乌增加了玉米叶内生细菌的种类。

3.2 玉米不同种植方式对其内生真菌的影响

不同处理玉米根内生真菌数目统计，显示，A处理共8株，属于曲霉属、木霉属、镰刀属及拟茎点属4个属； B处理共6株，属于镰刀属、木霉属及曲霉属3个属；C处理（CK）共3株，属于木霉属和镰刀属2个属。说明单株种植减少了玉米根内生真菌种类，玉米间作黄草乌使玉米根内生真菌种类增多。

不同处理玉米茎内生真菌数目统计显示，A處理共6株，属于木霉属、镰刀属、赤霉菌属、篮状菌属4个属；B处理共4株，属于木霉属、镰刀属、曲霉属及拟茎点属4个属；C处理（CK）共3株，属于镰刀属、曲霉属2个属。说明单株种植减少了玉米茎内生真菌的种类，玉米间作黄草乌增多了玉米茎内生真菌种类。

不同处理玉米叶内生真菌数目统计显示，A处理共4株，属于拟茎点属、镰刀属及曲霉属3个属；B处理共2株，属于曲霉属和木霉属2个属；C处理（CK）共1株，属于赤霉菌属。说明单株种植减少了玉米叶内生真菌种类，玉米间作黄草乌增加了玉米叶内生真菌种类。

4 讨论

研究表明玉米本身在根茎叶等组织器官中含有丰富的内生菌，这些丰富的内生菌有特殊的化学结构或者会释放一些特殊的化学物质[7]，是玉米抗病及增产的一个机制。内生菌伴随着植物的一生，在植物的生长过程中，有益内生菌的种类越丰富，则越有利于植物的生长。因此，研究不同种植方式玉米内生菌多样性的变化情况，有利于找到对玉米抗病及增产有利的菌株。关于玉米内生菌的研究已经有了一个比较完备的结果，但是即使是同一品种的玉米，内生菌的种类构成也不是一成不变的，因为不同种植方式会对内生菌的种类构成产生影响。由A、B及C处理（CK）三种试验结果，玉米间作黄草乌与玉米单作及玉米单株种植相比增加了玉米内生菌的数目。这与杨建波等人利用甘蔗及大豆间作，结果甘蔗茎内生菌数量增加是一致的[8]。但有关玉米与黄草乌间作对内生菌影响的研究

鲜有，因此，本研究还需进行进一步验证。由查阅文献得，A处理中的促生菌及生防菌数量比B及C处理得都多，因此，本试验可能找到对玉米抗病、增产有益的菌株。但是玉米间作黄草乌模式是否可以固定的产生有益内生菌株及是否有利于大田生产，还需要进行进一步及多次的试验。

参考文献

[1] 姚领爱，胡之璧，王莉莉，等.植物内生菌与宿主关系研究进展[J].生态环境学报，2010，19（7）：1750-1754.

[2] 李晔，田红琳，张丕辉.玉米内生菌研究进展[J].作物研究，2017，31（6）：709-712.

[3] 沈玥.玉米内生放线菌的筛选、鉴定及抑制玉米大斑病菌机理研究[D].东北农业大学，2014.

[4] 傅晓方，韩红江，郝勇锋，等.玉米内生固氮菌的分离鉴定及对小麦幼苗的促生效应[J].西北农业 学报，2012，21（1）：66-71.

[5] 韩梅，罗培宇，肖亦农，等.玉米内生固氮菌的分离鉴定及其促生长作用研究[J].沈阳农业大学学报，2010，41（1）：94-97.

[6] 代真林，汪娅婷，姚秀英，等.玉米大豆间作模式对玉米根际土壤微生物群落特征、玉米产量及病害的影响[J].云南农业大学学报（自然科学），2020，35（5）：756-764.

[7] 曹鹏飞，刘青娥.杨梅枯萎病拮抗内生菌的分离及其抑菌机制研究[J].河南农业科学，2021（4）：96-105.

[8] 杨建波.间作大豆对甘蔗生长及内生细菌、固氮细菌多样性的效应[D].广西大学，2014.