ZEA对大鼠睾丸支持细胞线粒体损伤和细胞凋亡的影响

闻 丹

（靖江市生祠畜牧兽医站，江苏 靖江 214500）

1 玉米赤霉烯酮研究进展

玉米赤霉烯酮由镰刀菌属所产生，是一种具有雌激素样的代谢产物，它是一种非甾体雌激素类霉菌毒素，是重要农作物的常见污染物之一。大部分地区都受到不同程度的ZEA污染，ZEA的分布遍布全球，涉及玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、大米等多种农作物。它的耐热性比较强，在110℃的高温下处理1h才会被完全破坏，其结构与哺乳动物的激素β-雌二醇相似，能和雌激素受体结合，引起动物高雌激素症状。玉米赤霉烯酮的危害在临床上最为常见的是会影响动物的生殖系统，导致动物繁殖障碍，给畜牧业发展带来了损失。

2 睾丸支持细胞的研究进展

睾丸支持细胞又称Sertoli细胞，它位于睾丸的曲细精管内皮，支持细胞包围着精原细胞和其他生精细胞，是与生精细胞直接接触的体细胞，其紧密连接会形成血睾屏障，保护精原细胞不遭受外界的侵扰。Sertoli细胞也可以吞噬凋亡的生精细胞，影响精子的成熟。

3 玉米赤霉烯酮与线粒体损伤

线粒体是细胞活力、生存和死亡的调解中心，其结构与功能异常会导致细胞功能的紊乱。众多研究表明ZEA具有雌激素样活性，通过与雌激素受体结合之后，会引发各类雌激素样作用，使得动物生殖障碍[1]。

4 研究目的及意义

玉米赤霉烯酮会对动物繁殖产生一定的影响，已经有多位学者证实了其对雌性动物会出现生殖细胞凋亡、周期紊乱、早熟等现象。本试验为了探究ZEA对睾丸支持细胞线粒体损伤的影响，使用不同浓度的ZEA处理大鼠原代睾丸支持细胞24h后，分别用CCK-8法测定细胞活率，透射电镜观察染毒后超微结构的损伤情况，免疫荧光法及流式细胞术检测ZEA对线粒体的影响程度和凋亡率。这对揭示ZEA致睾丸支持细胞线粒体损伤的机制具有重要意义，为进一步研究玉米赤霉烯酮致睾丸支持细胞生殖毒性的机理提供理论依据。

5 材料与方法

5.1 实验动物

雄性Wistar大鼠（16～18日龄），购于扬州大学比较医学中心。

5.2 主要试剂与仪器

DMEM/F-12 Gibco，美国

胎牛血清 Hyclone，美国

细胞凋亡双染试剂盒 BD，德国

胰蛋白酶 Amresco，德国

Ⅱ型胶原酶、ZEA标准品 Sigma，美国

FACS Aria型流式细胞仪 BD，美国

二氧化碳培养箱 Thermo，美国

CM-100透射电子显微镜 PHILIPS，荷兰

5.3 试剂配制

（1）PBS的配制：分别称取KH2PO4 0.5g，KCl 0.5g，Na2HPO4·12H2O 7.25g，NaCl 20g，然后用去离子水（DDW）混匀定容至500ml，配制成浓度为5%的母液并进行过滤除菌，终浓度为1%。

（2）0.5%胶原酶溶液的配制：称取I型胶原酶0.02g、BSA 0.04g，加入PBS混匀定容至20ml。0.22μm过滤除菌。

（3）0.25%胰蛋白酶溶液的配制：称取胰蛋白酶 0.05g，加入PBS混匀定容至20ml，0.22μm过滤除菌。

（4）ZEA母液的配制：规格为25mg/瓶的ZEA添加785μLDMSO，溶解得到母液，-20 ℃保存备用。

5.4 大鼠原代睾丸支持细胞的分离与培养

处理Wistar大鼠，脱颈致死，全身浸泡消毒后腹部朝上固定于解剖板上。实验过程中所用器械均已高压灭菌完成，在无菌条件下，用眼科剪剖开大鼠腹腔，于腹股沟处提拉精索取出睾丸，将睾丸在预冷无菌的PBS溶液中清洗三遍后放入培养皿。拉散曲细精管后置于浓度为0.25%胰蛋白酶溶液（37℃）中，水浴摇床预热37℃将曲精细管放入其中，150r/min消化15-20min后睾丸组织碎块成粘稠线索状，随后加入一体积含血清的DMFM/F-12培养基，800g，4 ℃离心10 min。弃去上清液，加入0.5%胶原酶溶液（37℃），密封后放于水域摇床中，37℃，150r/min消化15-20min后溶液为粘稠状，加入等体积含血清的DMFM/F-12培养基终止消化，用灭菌过的100目网筛过滤后800g/min 4℃离心10min。离心后无血清培养基重悬离心三遍，接种于培养皿，于37 ℃、5 % CO2条件下培养24h。实验采取低渗法纯化睾丸支持细胞，弃培养基，灭菌预热的PBS洗涤三次将未贴壁的睾丸间质细胞清除，之后加入20μM Tris-Hcl（pH=7.4）处理3min，将不耐低渗的生精细胞胀破从而保留支持细胞。弃处理液，灭菌预热PBS清洗三次，最后加入含血清的DMFM/F-12培养基继续培养。

5.5 细胞染毒方法

将睾丸支持细胞在37℃、5 % CO2的条件下培养24h，用0、5、10、20μmol/L（二甲基亚砜配制）的玉米赤霉烯酮浓度染毒24h。

5.6 透射电镜观察细胞超微结构

将睾丸支持细胞以1.0×106cells/ml的方式，均匀接种10ml于细胞培养皿（直径10cm）中，在37℃、5%CO2的条件下培养24h，染毒后继续培养24h，收集所有悬浮和贴壁细胞。800g离心10min，弃上清液后贴管壁慢慢加入预冷的2.5%戊二醛1ml，在4℃静置过夜进行固定。固定结束后，用预冷的PBS进行3次漂洗。用系列梯度的乙醇进行脱水后再用丙酮除去乙醇。以1%俄酸室温处理2h，用环氧树脂包埋，干燥，磨片，并采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对支持细胞进行染色，随后于透射电镜下观察细胞的超微结构变化。

5.7 荧光探针法观察ZEA对线粒体损伤的影响

接种细胞浓度以3.0×105个/ml于铺有无菌盖玻片的24孔细胞培养板中培养24h。不同浓度ZEA处理24h后，弃去培养基，加入37℃温育的Mito-Tracker Green染液（线粒体绿色荧光探针），孵育15～45min；接着弃去染色液，加入培养液在荧光显微镜下进行观察。

5.8 细胞凋亡的检测

根据AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒操作方法，检测睾丸支持细胞凋亡的情况。将原代睾丸支持细胞以每孔1.0×105个细胞的密度接种于6孔板中，添加不同浓度ZEA处理细胞24h。取上清液胰酶消化，加入1ml PBS，轻吹打细胞；1500r/min离心10min。洗涤2次后收集细胞，设置成三组进行对比，分别为空白组（未加染料）、FITC单染组、PI单染组以及双染处理组（FITC和PI）。加入染料组之后，在室温避光的环境下孵育30min后以1×l0Loading buffer 500μL重悬细胞，200目尼龙网过滤，每组处理三次重复。1h之内流式细胞仪检测分析，每组检测104个细胞。

6 结果

6.1 ZEA染毒浓度的确定

使用不同浓度ZEA（0、5、10、20、40 μM）作用于睾丸支持细胞24h，采用CCK-8法测得，各组细胞活率会随着ZEA染毒浓度升高而降低。当ZEA浓度为40μM时细胞活率低于半数致死量。

6.2 ZEA对睾丸支持细胞线粒体损伤的观察

不同浓度ZEA作用于睾丸支持细胞24h，通过投射电镜观察线粒体的变化。如图1所示，对照组的线粒体完整，脊排列整齐规律；5μmol /LZEA线粒体出现肿胀；10μmol /LZEA线粒体肿胀现象加剧；20μmol /LZEA组线粒体出现脊脱落甚至消失，线粒体肿胀增多，空泡化增多。

图1 不同浓度ZEA对睾丸支持细胞核的影响

6.3 ZEA对睾丸支持细胞线粒体的损伤

采用Mito-Tracker Green法检测线粒体ZEA对线粒体的影响。结果显示与对照组相比，染毒组（5、10、20μmol/L）荧光表达呈极显著升高。

6.4 ZEA对睾丸支持细胞凋亡的影响

运用流式细胞术检测睾丸支持细胞的凋亡率。如图2显示，染毒浓度的增加使得睾丸支持细胞的早期凋亡和晚期凋亡数量呈上升趋势，在20μM浓度ZEA作用下凋亡率呈最高值。

图2 ZEA对睾丸支持细胞凋亡水平

7 讨论

近年来，有大量研究和实验证实了ZEA能够导致雄性生殖细胞和睾丸间质细胞死亡[2]，影响精子的正常发生。ZEA能够影响雄性小鼠的精子参数，降低繁殖能力，改变内分泌腺的重量和抑制间质细胞中睾酮的合成[3]。本实验采用不同浓度ZEA作用于睾丸支持细胞24h，通过CCK-8法测得40μM时细胞存活率低于半数致死量，证明ZEA在高浓度下明显抑制睾丸支持细胞的生长，并呈剂量-效应关系。采用投射电镜观察发现，随着ZEA暴露浓度升高，大鼠原代睾丸支持细胞出现线粒体脊肿胀、脱落甚至空泡化等超微结构的变化，说明ZEA可导致睾丸支持细胞线粒体损伤。运用流式细胞术检测发现ZEA染毒组的细胞凋亡率呈极显著升高，说明了ZEA可致睾丸支持细胞线粒体发生凋亡，具体的凋亡途径及机制还有待进一步的研究。