纳米TiO2处理对山定子响应重茬土壤胁迫的生理效应研究

张悦　牛洁　王诗琦　刘兴萍　王延秀

关键词：山定子；TiO₂；重茬土壤；生理特性；主成分分析

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：2097-2172（2023）07-0654-08

粮食安全对农业基础地位的夯实具有重要意义，因土地资源有限及国家政策不允许占用耕地新建果园等因素的影响，为了旧果园迭代更新、提质增效，必须重茬建园，即在老产区同一块土地连续多年重茬种植同一种果树。重茬建园易引发再植障碍，通常表现为生长受到抑制、产量低甚至死亡，影响果园“整齐度”及经济效应发挥。中国苹果种植总面积达200万hm²左右，总产量4200万t，具有明显的规模化产业优势。甘肃属于西北黄土高原苹果重点产区，是我国重要的苹果优势产区，其气候、土壤、环境等多项因素均与优质苹果生产所需条件高度吻合，具有得天独厚的区位优势。甘肃省目前初步形成了以静宁、西峰、泾川为中心的陇东黄土高原区和以天水为中心的陇南浅山丘陵区两大苹果优势产区，全省苹果种植面积为24.11万hm²，总产量达340.47万t，分别居全国第3位和第5位，苹果已成为甘肃优势特色产业和农民脱贫增收的主导产业。但目前甘肃省有16%以上的果园走向“老龄化”，重茬建园技术亟须解决。研究发现，施用适宜的外源纳米材料可有效改善作物再植障碍问题，目前已在棉花、番茄、小麦等作物上得到验证。

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸（0.1～100.0 nm）或由它们作为基本单元构成的材料，且只有通过细胞壁和细胞膜才能被细胞吸收，从而对植株生长发育产生一定影响。刘娅等在小麦中发现，纳米TiO₂的施用有效缓解了Cd对小麦带来的氧化胁迫，显著提高了小麦生物量、根长等。梁鹏鹏在紫甘蓝中发现，纳米Ti02对紫甘蓝光合作用和叶绿素含量具有明显的浓度效应。郑泽其等研究表明，纳米TiO₂有望应用于强化植物修复土壤Cd污染。张萍研究表明，纳米TiO₂溶胶不仅对多种植物病害具有明显的防治作用，同时可促进植株生长发育。此外有研究表明，纳米TiO₂能够增强玉米幼苗的抗氧化酶活性。然而纳米TiO₂的研究大部分集中在蔬菜和其他作物上，而在木本植物特别是苹果砧木上是否具有相似的生理响应尚不清楚。

我们以一年生苹果砧木山定子为试验材料，研究和分析不同浓度纳米TiO₂对连作胁迫苹果砧木山定子的影响，旨在探讨外源TiO₂对重茬环境中山定子幼苗生理特性的响应，以期为苹果砧木生产实践提供一定的理论指导。

1材料与方法

1.1材料与处理

试验选择长势一致、生长健壮的一年生苹果砧木山定子，2021年5月中下旬将苗木定植于大小相同、装有1962年国光苹果园重茬土塑料花盆内（11.2 cm×16.8 cm），每盆1株，并置于甘肃农业大学避雨棚（360°10′N、103°34′E）进行统一管理，定期浇水、除草。

试验共设5个处理，分别为重茬土壤不加TiO₂（CK）、重茬土壤+0.5 g/kg TiO₂（T1）、重茬土壤+ 1.0

g/kg TiO₂（T2）、重茬土壤+2.0 g/kg TiO₂（T3）、重茬土壤+4.0 g/kg TiO₂（T4），每处理3个重复，每个重复3盆。其中，纳米TiO₂以拌入土壤的方式进行施用，每盆土壤质量为5.0 kg，按所设浓度拌人相应质量的纳米TiO₂。2021年7月初，自施用纳米TiO₂次日开始计算时间，于第0、10、20、30 d时选取生长一致的中上部相同节位叶片保存于超低温冰箱，进行各项指标测定与分析。

1.2生理指标的测定

1.2.1光合色素含量[叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）]的测定参考综旭林等的测定方法。采集叶片，用蒸馏水洗净其表面，剪碎，倒入80%丙酮，在黑暗条件下浸泡提取24 h，测定其663、646nm下的吸光度，代入公式计算Chl a、Chl b含量，两者之和为Chl a+b，两者之比为Chla/b，生物学重复3次。

1.2.2抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）]活性的测定参考买合木提·卡热等的方法，生物学重复3次。

1.2.3相对电导率和脯氨酸的测定 相对电导率（REC）采用电导率仪型号（DDS-307）进行测定；脯氨酸（Pro）含量参照Guo R等测定方法，生物学重复3次。

1.2.4丙二醛（MDA）含量測定 参考赵世杰等的测定方法，生物学重复3次。

1.3数据处理与分析

用Microsoft Office Excel 2019及Origin 2018进行数据处理及作图，用IBM SPSS Statistics 26进行相关性、主成分分析，分析采用单因素ANOVA的LSD法比较差异的显著水平（a=0.05）。

2结果与分析

2.1纳米Ti02对重茬条件下山定子叶片光合色素含量的影响

从图1-A可以看出，随胁迫时间延长，除处理T3至20 d外，各处理Chl a含量呈下降趋势。处理至10 d时，各处理的Chl a含量差异均不显著，但处理组Chl a含量均高于CK。处理至20 d，各TiO₂处理下的Chl a含量均高于CK，分别为28.24 mg/g（Tl）、29.02 mg/g（T2）、29.55 mg/g（T3）、26.44 mg/g （T4），其中处理T2、处理T3均显著高于CK，分别为CK（25.36 mg/g）的1.14、1.17倍。处理至30 d时，处理T2、处理T3的Chl a含量均显著高于CK，而处理T1、处理T4均与CK差异不显著。

由图1-B可知，各处理的Chlb含量变化趋势与Chla大体相同，胁迫期间Chlb含量随时间延长均呈下降趋势。除处理T4在30d外，其余处理在各时间段的Chlb含量降幅均小于CK，且具有明显浓度效应。处理至30d时，各处理的Chlb含量均达到最低值，除处理T4低于CK外，其余TiO₂处理均高于CK，且处理T2、处理T3的Chlb含量均显著高于CK，但降幅以处理T3最小，为10.17%。

图1-C表明，各处理的Chl a+b含量变化趋势与Chl a、Chl b含量趋势变化一致。Chl a+b含量随胁迫时间的延长不断下降，处理至10、20、30d时，均随TiO₂浓度增加，整体均呈先升后降的趋势，且均以处理T3的Chl a+b含量最高，处理T2、处理T3的Chl a+b含量亦显著高于CK。

从图1-D可以看出，在重茬胁迫下，山定子叶片的Chl a／b变化幅度小。施加TiO₂后，随胁迫时间的延长，各处理Chl a/b变化规律不尽相同。Chl a/b在处理至10、20、30 d时，均以处理T4最高，分别为2.00、1.95、2.19，除在处理20d时与CK差异显著，其余处理均与CK差异不显著。

2.2纳米TiO₂对重茬条件下山定子叶片抗氧化酶活性的影响

从图2-A可以看出，随处理时间的延长，处理Tl、T2、T3、T4山定子幼苗叶片SOD活性呈先升后降的趋势。处理20 d时，各处理均达到峰值后不断降低，但不同处理各时间段对SOD活性的升幅不同。处理至20 d时，处理T3的SOD活性最高（131.97 U/g），且显著高于CK（85.70 U/g），是CK的1.54倍，其余处理也均显著高于CK。

图2-B表明，重茬条件下，随胁迫时间的延长，各处理下山定子叶片的POD活性和SOD活性的变化大致趋势相同。试验处理10 d时，处理T2、T3、T4的POD活性均显著高于CK。处理至20 d时，处理T3的POD酶活性达到峰值，为77.65 U/g，显著高于CK（44.06 U/g），为CK的1.76倍。处理至30 d时，处理T1、T2、T3、T4的POD活性均下降，但各处理POD活性仍高于CK，分别为CK的1.48、1.88、2.17、1.87倍。

由图2-C可知，重茬条件下，随TiO₂处理时间的延长，各处理的CAT活性整体呈先升后降的趋势。试验处理至10d时，处理T4的CAT活性达到峰值，为4.872 U/（g.min），试验处理至20 d时，处理T1、T2、T3的CAT活性均达到最大，分别为5.265、5.848、6.621

U/（g·min）。处理至30 d时，处理T1、T2、T3的CAT活性均显著高于CK，其中处理T3[5.973 U/（g·min）]增加幅度最大，为CK[4.163 U/（g·min）]的1.43倍。

2.3纳米TiO₂对重茬条件下山定子叶片REC和Pro含量的影响

由图3-A可知，随着处理时间的延长，各处理的REC均呈升高趋势，但升幅不同。0d时，处理T1、T2、T3、T4与CK的REC无显著差异；处理至10d时，处理T1、T2、T3、T4处理叶片REC升幅均低于CK （9.88%），分别为7.81%、6.72%、2.87%、5.90%；处理至30 d时，处理T1、T2、T3、T4叶片REC均显著低于CK，与Od相比，处理T1、T2、T3、T4的REC分别提高了28.88%、25.77%、10.36%、20.39%，整体来看，处理T3叶片REC的增幅最小。

图3-B表明，随处理时间的延长，各处理叶片Pro含量整体大致呈先升后降的趋势。胁迫至10 d时，各处理的Pro含量出现明显的增加，随Ti02浓度的增加，Pro含量整体上呈先升后降的趋势；胁迫至20 d时，处理T1积累量最小，为32.41 mg/g;处理T2积累量最大，为35.27 mg/g。但与CK（24.37 mg/g）相比，处理T1的Pro含量提高了32.99%，处理T2的Pro含量提高了44.71%。

2.4纳米TiO₂对重茬条件下山定子叶片MDA含量的影响

图4表明，重茬条件下山定子叶片MDA含量随处理时间的延长呈先上升后下降趋势，随着Ti02施用浓度的变化，MDA含量变幅有所不同。处理至30 d时，处理Tl、T2、T3、T4的叶片MDA含量与CK相比，以处理Tl变化幅度最小，MDA含量与CK差异不显著。

2.5重茬条件下不同浓度纳米TiO₂对山定子生理效应的综合评价分析

2.5.1相关性分析 使用SPSS软件对重茬胁迫后的10个指标进行相关性分析，获得相关系数矩阵（表1）。结果表明，砧木山定子叶片的Chl a与Chl b、POD、Pro呈显著正相关（P<0.05），与Chla+b、SOD呈极显著正相关（P<0.01），与Chl a/b、CAT、REC、MDA呈负相关，表明可以通过上述指标等来评价纳米Ti02对重茬胁迫下山定子的改善作用。

2.5.2主成分分析 为综合评价重茬条件下不同浓度纳米TiO₂对山定子的生理效应特性研究，将纳米TiO₂处理后的10个指标（Chl a、Chl b、Chl a+b、Chl a/b、SOD、POD、CAT、REC、Pro、MDA）进行主成分分析，提取到2个特征值大于1的主成分，其特征值分别为9.43，2.01（表2）。第一、二主成分方差贡献率分别为83.18%、10.05%，累计方差贡献率达到93.23%，符合分析要求。

综合得分（F）是每个主成分得分与相对应方差贡献率的乘积之和，即F=PC1×0.8318+PC2×0.1005。由表3可知，山定子在不同处理下综合得分分別为-1.31（CK）、0.10（Tl）、0.37 （T2）、0.96（T3）、-0.12（ T4），因此，在重茬条件下山定子叶片在不同浓度纳米Ti02处理下的综合排名由高到低依次为处理T3、处理T2、处理T1、处理T4、CK。

3讨论与结论

光合作用是植物生长发育的基础。叶绿素是进行光合作用主要色素，长时间的重茬胁迫会使叶绿素与叶绿体蛋白结合松弛，进而降低叶片的光合能力，使光合产物积累降低，最终导致生长量显著下降。本研究在重茬条件下，随时间延长，山定子叶片的叶绿素含量均呈下降趋势，施加纳米TiO₂后，山定子叶片的叶绿素含量呈不同程度的上升趋势；当TiO₂浓度增加到4g/kg时，对其缓解作用并未继续增强，这与于敬波等在水稻中的研究结论相似。进一步证实TiO₂在一定浓度下可以有效缓解植物遭受胁迫所受伤害。可能是由于纳米材料的吸附到植物根系表面，阻塞细胞壁小孔，影响水分和营养物质的吸收与运输，导致植株无法正常生长发育，甚至产生毒害。

研究表明，在正常环境下植物体内活性氧的产生与清除处于动态平衡，当植物遭受逆境胁迫时，这种动态平衡就会被打破，产生大量活性氧。非生物胁迫下，植物自身会启动酶促和非酶促两类保护系统来减轻或消除活性氧自由基的伤害。本研究中，随着重茬胁迫时间的延长，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性呈下降的趋势，这可能是重茬胁迫干扰了植物正常的生理功能，引起体内活性氧的积累，导致膜脂过氧化作用，破坏细胞膜系统，影响细胞内蛋白质物质的合成，从而使抗氧化酶活性下降。通过不同浓度纳米TiO₂处理后，山定子叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性均显著高于重茬土壤+0.0 g/kgTiO₂，且具有明显的浓度效应，这可能是外源TiO₂增强了植物抗氧化系统的防御能力，维持细胞膜系统的平衡，从而在一定程度上缓解了重茬胁迫引起的氧化损伤，这与李玲玲等在植物病原微生物中的研究结果一致。

植物老化或受到伤害时，易发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）含量和相对电导率（REC）是反映逆境胁迫对植物细胞膜脂过氧化伤害程度的重要参数。丙二醛（MDA）从膜上产生的位置释放出来后，可以与蛋白质、核酸起反应修饰其特征。本研究中，重茬胁迫使得山定子叶片的丙二醛（MDA）含量增加，其生长受到抑制，施加一定浓度的纳米TiO₂可有效降低膜脂过氧化，丙二醛（MDA）上升速率减缓，进而在一定程度上缓解了重茬胁迫对山定子叶片的毒害作用，维持幼苗的正常生长。相对电导率（REC）反映植物细胞膜稳定性，重茬胁迫可改变细胞膜的通透性。该实验中，在胁迫条件下，山定子幼苗相对电导率一直呈上升趋势，且增幅较大，可能是由于重茬障碍导致细胞膜受损，进而使得细胞内电解质外渗，施加TiO₂后山定子幼苗叶片的相对电导率（REC增幅减小，由此说明纳米TiO₂可以缓解重茬胁迫下山定子叶片细胞膜透性的增大和膜脂过氧化程度的增加，改善胁迫造成的危害。这与Mustafa等在小麦中研究结果一致。

脯氨酸（Pro）在植物遭受胁迫时可在体内大量积累以保护细胞结构，同时，脯氨酸（Pro）还可以调节细胞渗透压，稳定分子结构。本研究发现，重茬胁迫下施入纳米TiO₂后山定子叶片的脯氨酸（Pro）含量明显高于对照处理（重茬土壤+0.0g/kgTiO₂），这与Emamverdian等在矮竹中的研究結果分析一致。可能是由于施入TiO₂后，导致渗透调节物质积累，进而改善重茬胁迫。

植株重茬胁迫改善受多种因素影响，单个指标无法准确反映其改善机制，本研究中对重茬胁迫后的山定子叶片的各指标进行综合评价。由相关性分析可得，山定子叶片的叶绿素a（Chl a）与叶绿素b（Chl b）、过氧化物酶（POD）、脯氨酸（Pro）呈显著正相关（P<0.05），与叶绿素a+b（Chl a+b）、超氧化物歧化酶（SOD）呈极显著正相关（P<0.01），说明叶绿素b（Chl b）含量、过氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量降低是影响叶绿素a（Chl a）含量降低的原因。由此可见，TiO₂可以通过调节抗氧化酶活性和渗透物质含量，从而清除活性氧，以维持抗氧化酶系统的稳定性，降低胁迫下膜透性损害，维护细胞膜的结构和功能，且具有一定的浓度效应，其中，以重茬土壤添加2.0 g/kg的TiO₂的缓解作用效果最佳。

将重茬胁迫处理后相关的10个指标[叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、叶绿素a+b（Chla+b）、Chl a/b、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、相对电导率（REC）、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）]进行主成分分析，提取特征值大于1的2个主成分，其特征值分别为9.43、2.01；第一、二主成分方差贡献率依次为83.18%，10.05%，累积方差贡献率达到93.23%，符合分析要求。主成分分析结果表明，TiO₂对山定子重茬胁迫缓解能力高到低依次为重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加1.0 g/kg TiO₂、重茬土壤中添加0.5g/kg TiO₂、重茬土壤中添加4.0g/kg TiO₂、重茬土壤+0.0 g/kg TiO₂。由此可知，在重茬土壤中添加2.0 g/kg TiO₂，可通过改善重茬胁迫下山定子的光合能力、ROS清除机制、稳定细胞膜结构来减缓重茬障碍对苹果幼苗的危害。