2个新育成黄芪品种（系）的RAPD研究

刘效瑞，杨 宁，王春明，尚虎山，汪淑霞，王兴政

（1.甘肃省定西市旱作农业科研推广中心，甘肃 定西 743000；2.西北师范大学，甘肃 兰州730070）

我国中药材资源丰富，是世界药材的主产国，对中药材的研究有几千年的历史。甘肃省自然条件虽然恶劣，但却是中药材生长的适宜地带，中药材生产在全国具有明显的竞争优势，为全国中药材优势产区和生产大省，其中黄芪栽培面积和产量约占全国的50%左右。黄芪（Radix Astragali）又名黄耆，为植物和中药材的统称。植物黄芪产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，为国家三级保护植物。黄芪是临床常用中药材，其化学成分众多，主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类等有效成分。黄芪来源于豆科植物膜荚黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge］和蒙古黄芪［Astragalus membranaceus （Fisch）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，为我国传统的补气药［1～3］。黄芪的药用迄今已有2 000多年的历史，大量的临床研究证实，黄芪具有保护心脏及肾脏、双向调节血糖及血压、抗缺氧、抗自由基氧化、抗衰老、抗肿瘤及增强机体免疫力等功效［2～3］。目前甘肃黄芪栽培中普遍使用的品种为黄芪属多种类型的混和体，田间表现良莠混杂，难于管理，且品种（系）亲缘关系不明确，缺乏品种（系）鉴定的分子依据，严重制约着当地黄芪的产量和品质。另外，药材的道地性一直是评价药材品质的综合性标准，产生道地性的原因，除了栽培方法、生态环境、加工方法外，还与物种居群的遗传特异性有关。道地药材与非道地药材在形态和生药性状等特征上的差别并不明显，这给应用传统方法鉴别道地药材带来了困难。

随机扩增DNA多态性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技术以其操作简单、快速、花费少、DNA用量少、无放射性等优点，广泛应用于中草药种质资源亲缘关系、遗传多样性及药材道地性研究等方面［4～5］。我们针对甘肃省黄芪生产及销售实际中不能提供科学的药材道地性鉴定等问题，利用RAPD技术对甘肃省定西市旱作农业科研推广中心新选育的2个黄芪品种（系）进行分析鉴定，以考证其遗传多样性和亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试黄芪样品为陇芪1号（编号为HQ1）、HQN03-03（编号为HQ2），均由甘肃省定西市旱作农业科研推广中心提供。于2011年7月20日分别采集2个黄芪品种（系）的幼叶各50片，用硅胶干燥后带回实验室。RAPD引物由北京奥科生物技术公司生产，所用Taq酶及dNTPs购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取 采用SDS法提取植物基因组DNA［6～7］。称取0.3 g干叶片，加液氮研磨至粉末状移入离心管，加入4mL已预热到65℃的提取液充分混匀，65℃水浴30min，每3min混匀1次。向离心管中加入等体积的氯仿异戊醇（24∶1）抽提1 h，8 000 r/min离心15min，取出上清液，再抽提2次，而后加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，混匀后放在-20℃下静置30min，吸出无水乙醇后加入70%乙醇，并轻柔混匀30 s，重复4～5次，以去除杂质。将DNA挑出后放入已加入300 uL TE液的离心管中，待DNA完全溶解后分装，4℃下保存待用。对提取的2个供试黄芪品种（系）的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，为后期PCR扩增提供良好的模板。

1.2.2 PCR扩增 扩增反应在BIO-RAD普通型PCR仪上进行。采用RAPD分子标记技术，分析鉴别新选育出的2个黄芪品种（系）的遗传多样性和亲缘关系。采用SDS方法提取植物基因组DNA，利用RAPD—PCR扩增反应体系（①RAPD反应体系模板DNA 1.2 uL，随机引物2.0 uL，dNTPs 1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶 0.5 uL，加ddH2O至25.0 uL；②扩增程序为94℃预变性5min后，94℃1 min，35℃ 1 min，72℃ 2 min，共计40个循环，最后72℃延伸10 min。） 进行PCR扩增反应。然后采用1.4%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，UVI凝胶图像分析系统观察照相。每个实验重复3次。

1.2.3 数据处理 参照Williams等的方法［8］，电泳扩增图谱中的每一条带（DNA片段）均为一个分子标记（Marker），并代表一个引物结合位点，根据各分子标记在相同电泳迁移率下（相同分子量片段）的有无，统计得到所有位点的二元数据，有DNA扩增带（显性）为1，无带（隐性）记为0，强带和弱带赋值为1。对于多态性位点，采用在重复试验中能稳定出现的差异带用于数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同引物对2个黄芪品种（系）的扩增结果

从表1可以看出，通过引物筛选，分别从HQ1和HQ2中挑选出谱带清晰、重复性好、多态性较丰富的12条和13条随机引物，用于PCR扩增反应。从HQ1挑选出的12条引物为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、 P12、P13、P14、P15 ，从 HQ2挑选出的13条引物为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P13、P15。从HQ1筛选出的12条引物共扩增出112个位点，不同引物的扩增位点变幅为7～13个，平均每条引物能扩增出9.3个位点；从HQ2筛选出的13条引物共扩增出107个位点，不同引物的扩增位点变幅为6～12个，平均每条引物能扩增出8.2个位点。

表1 2个新选育黄芪品种（系）的引物序列和扩增结果

2.2 相同引物对2个黄芪品种（系）的扩增结果

利用HQ1和HQ2可共用的12条引物，分别扩增2个黄芪品种（系），从而在分子水平上反映2个黄芪品种（系）间的遗传差异性。筛选出的12条引物分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、 P7、P9、P10、P13、P14、P15（引物及其扩增条带数见表1）。结果显示，HQ1和HQ2的主谱带基本一致，说明它们的遗传背景具有很大的相似性，但是两者间的次谱带存在明显差异。相同引物扩增2个黄芪品种（系）产生的总位点数的范围为13～25个；其中多态性位点的差异变幅为1～3个。这说明2个黄芪品种（系）间存在遗传学差异，具有遗传多态性位点（图1）。

图1 HQ1和HQ2的RAPD电泳图谱

3 小结与讨论

本研究对模板DNA含量和dNTPs含量两个因素进行了优化分析，建立了适合黄芪材料的RAPD—PCR扩增反应体系，并对引物退火温度和电泳中琼脂糖浓度进行了筛选，最终确定了黄芪的最适RAPD—PCR扩增反应体系为：模板DNA 1.2 uL，随机引物2.0 uL，dNTPs1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶0.5 uL，ddH2O 17.5 uL；RAPD引物最佳退火温度为35℃，最适琼脂糖浓度为1.4%。此体系的建立可以为其它黄芪品种（系）的RAPD扩增提供参照依据。

RAPD是一种显性标记，能从分子水平上揭示材料间存在的遗传差异［9～11］。从RAPD的结果可以看出，陇芪1号筛选出的12条引物共扩增出112个位点，平均每条引物能扩增出9.3个位点；HQN03-03筛选出的13条引物共扩增出107个位点，平均每条引物能扩增出8.2个位点。供试的2个黄芪品种（系）的主谱带基本一致，说明它们的遗传背景具有很大的相似性，2个黄芪品种（系）间遗传关系较近。这种情况可能是由于供试的2个黄芪品种（系）在种植过程中地理分布近，且黄芪是自花不孕或自交不亲和的异花授粉植物［12］，从而使二者间相互授粉的几率大大提高，造成遗传关系较近。但次谱带存在不同程度的差异，从分子水平上说明这2个黄芪品种（系）具有一定的遗传差异性，也体现了甘肃省黄芪品种（系）资源具有较丰富的遗传多样性。

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