高产乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌性研究

王雅丽， 郗艳菊， 杨红亚， 陆 安， 郝庆红，4 ， 郭云霞， 吴国江

（1.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001；2.河北省功能性饲料添加剂技术创新中心，河北 石家庄 050011；3.石家庄九五堂生物科技有限公司，河北 石家庄 050011；4.河北省饲用微生物技术创新中心，河北 保定 071001）

随着抗生素耐药性、 残留及耐药菌株等问题的日益严重（Tian，2021；徐文豪，2019；Schokker，2017），2019 年7 月10 日， 国家农业农村部发布《中华人民共和国农业农村部公告第194 号》（农业农村部，2019），明确12 种促生长药物饲料添加剂退出历史舞台，从呼吁在饲料中“减抗替抗”，到现在国家正式出台“饲料禁抗”“养殖减抗”“食品无抗”相关政策法规，在这样的背景下，畜禽“无抗养殖”成为一种趋势。 研究报道，乳酸菌及其代谢产物可以降低肠道pH，抑制有害菌，促进机体免疫功能，提高饲料利用率，促进营养物质的消化吸收，达到防治疾病，提高动物生产性能目的（梅文晴，2021；Reuben，2019； 曾燕霞，2018； 刘凤美，2018）。将乳酸菌及其代谢产物代替抗生素是养殖业发展的一个方向， 因此有必要对乳酸菌及其代谢产物的相关作用进行一定的评估， 加快其在养殖业中的广泛应用。 本试验旨在筛选产酸能力较强的乳酸菌菌株，探究其抑菌性能，为其在养殖业中的广泛应用提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌（保存于河北农业大学生命科学学院药理学实验室）。

1.1.2 培养基 MRS 液体培养基由蛋白胨10.0 g；牛肉膏10.0 g；吐温80 1.0 mL；硫酸镁0.2 g；酵母粉5.0 g；无水乙酸钠5.0 g；硫酸锰0.2 g；磷酸二氢钾2.0 g；柠檬酸铵2.0 g；葡萄糖20 g；蒸馏水1000 mL 组成；冰乙酸调pH 至6.2 ～6.5。 MRS 固体培养基是在配制好的MRS 液体培养基中，1000 mL放入20 g 琼脂粉，灭菌备用。 MRS-CaCO3培养基是在无菌的MRS 固体培养基中，放入灭菌备用的CaCO3溶液，充分混匀。 NA 培养基由蛋白胨10.0 g；牛肉膏3.0 g；NaCl 5.0 g；琼脂20.0 g；蒸馏水1000 mL组成。 NB 培养基是液体NA 培养基，用于细菌的发酵。 PDA 培养基由马铃薯200.0 g； 葡萄糖20.0 g；琼脂20.0 g；蒸馏水1000 mL 组成，用于对峙培养。

1.1.3 主要试剂 2.5%石蕊溶液、 吲哚试剂、Nessler 试剂、结晶紫液、0.5%番红溶液等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验预处理 分离乳酸菌采用稀释涂布法，取10.0 g 鸡肠道样品放入锥形瓶中，加入90 mL灭菌备用的MRS 液体培养基中，180 r/min 振荡30 min 混匀， 置于37 ℃摇床培养24 h， 即制成10-1溶液。

1.2.2 乳酸菌的分离与筛选 准确吸取预处理的肠道样品的MRS 液体培养液1.0 mL，进行10 倍梯度稀释，将CaCO3-MRS 培养基溶解，倒入无菌平板中，待其凝固后，取合适梯度（10-5、10-6、10-7）菌液1.0 mL 分别进行平板涂布， 置于37 ℃恒温中培养48 h。 选择有较大溶钙圈的菌落，用竹签挑取，接种到MRS 斜面上， 平放于37 ℃培养箱中培养48 h，可将肠道中乳酸菌进行初步分离与筛选。将分离的乳酸菌菌株十字划线于倾注了CaCO3-MRS 固体培养基的平板上，37 ℃恒温培养48 h，观察记录溶钙圈直径； 从初筛中挑取较优良的菌株进行复筛，在CaCO3-MRS 固体培养基平板上， 打孔器打孔，取摇床培养48 h 的菌液50 μL 注入孔中，于37 ℃培养箱中培养48 h，记录溶钙圈的直径。

1.2.3 产酸菌株鉴定

1.2.3.1 菌落形态观察 观察菌落形态， 包括颜色、大小、形状、培养基颜色及溶钙圈等。挑取单菌落进行革兰氏染色和芽孢染色试验。

1.2.3.2 分子生物学鉴定 将筛选所得较优良菌株的菌体，接种到MRS 液体培养基中，置于37 ℃，摇床培养48 h 后备用。 使用试剂盒提取基因组DNA，PCR 反应体系如表1 所示， 首先对菌株进行革兰氏染色， 再按照北京百泰克公司生产的试剂盒使用手册进行操作。 用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化， 送华大基因技术服务有限公司测序， 序列用NCBI-BLAST 进行同源性比较，选取序列相似性高的标准菌株，用Clusta1.83和MEGA5.0 进行序列分析并构建发育树。

1.2.3.3 生理生化试验 将分离获得的菌株分别接种于相应的生理生化培养基，进行淀粉水解试验、V-P 试验、甲基红试验、吲哚产生试验、过氧化氢酶测定等生理生化试验。 参照 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，2001）和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》 对菌株进行鉴定 （赵斌，2002）。

1.2.4 发酵液中有机酸的测定 参照马瑞（2012）方法， 以乳酸 （纯度为98%）， 乙酸 （纯度为99.5%），柠檬酸（纯度为99.5%），用流动相溶解并定容至100 mL，所配制溶液均经0.22 μm 微孔滤膜过滤所得标准品。 有机酸测定色谱条件： Atlantis C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为0.01 mol/L 磷酸二氢钾∶甲醇=30∶70， 进样量30 μL，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，检测波长210 nm。

1.2.5 抑菌性能测定

1.2.5.1 菌悬液的制备 参照李凡姝（2016）方法制备L-2 菌株发酵液；参照杨雪海（2011）方法制备细菌菌悬液；参照Cheong（2014）方法制备真菌菌悬液。

1.2.5.2 抑菌性测定 参照张辉华（2001）方法制备NA 培养基平板， 测定对细菌的抑菌性； 参照Magnusson 等（2003）方法制备PDA 培养基平板，测定对真菌的抑菌性。

1.2.6 数据处理与统计 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，MEGA7.0 进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 高产乳酸菌的筛选 由表2 可知，初筛筛选所得到100 株菌株中，58 株菌株具有溶钙圈，溶钙圈超过20 mm 的有21 株。

表2 筛选所得菌株溶钙圈结果

从表3 可以看出，复筛得到H-1、L-2、C-2、B-8 4 株产酸活性强而稳定，且生长优良的菌株，其中菌株L-2 的透明圈最大。图1 为L-2 菌株在MRS 培养基上的溶钙圈， 图2 为菌株L-2 的发酵液中HPLC有机酸色谱图，其中乳酸含量最高，为49.85 g/L。

图1 L-2 菌株在MRS 培养基上的溶钙圈

图2 菌株L-2 发酵液HPLC 色谱图

表3 复筛四株菌的溶钙圈结果mm

2.2 菌落和菌体形态观察 将筛选得到的L-2 菌株，通过稀释涂布平板法，获得单菌落，观察、记录菌落形态、边缘等特征，挑取单菌落，然后再在显微镜下观察。 记录菌株的形态、边缘等结果（表4）。

表4 菌落与菌体形态

2.3 16S rDNA 测序结果

2.3.1 PCR 扩增电泳检测 以菌株LB-1-23 的基因组DNA 为模板对其16S rDNA 基因序列进行PCR 扩增，PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。

图3 菌株L-2 PCR 扩增电泳图

2.3.2 L-2 菌株系统树的构建 将L-2 菌株的拼接序列，基于NCBI 条件下，进行BLAST 比对搜索， 选取同源性较高时模式菌株的16S rDNA 基因序列，构建系统发育树。 如图4 可知，菌株L-2与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）聚在同一分支上，亲源关系最近，同源性为99%，再根据菌落与菌体形态，初步鉴定菌株L-2 为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图4 基于16S rDNA 基因序列L-2 菌株系统发育树

2.4 生理生化鉴定结果 从表5 生化试验结果可以看出，L-2 菌株在明胶液化、接触酶等方面与所验证菌株的生化特征保持一致性。由此表明，通过PCR 扩增电泳图，革兰氏染色，芽孢染色，生理生化验证等，从鸡肠道中筛选所得到的L-2 菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

表5 生理生化鉴定结果

2.5 菌株L-2 对肠道病原菌的抑菌作用 由表6、表7 可以看出，菌株L-2 发酵液对细菌、真菌均有广谱抑菌效果。 菌株L-2 发酵液对大肠杆菌、 沙门氏菌、 痢疾杆菌的抑菌圈直径分别为19.5、18.3、17.8 mm， 且对大肠杆菌的抑菌性优于其他两种致病菌。 菌株L-2 发酵液对尖孢镰孢菌等真菌也具有抑制性，且抑菌圈直径比细菌小，说明真菌对菌株L-2 发酵液的敏感度较低。 试验结果表明，从动物肠道中筛选得到的菌株L-2 发酵液对病原菌有很好的抑制性， 可有力减少肠道内细菌和真菌感染所致的疾病，改善肠道环境。

表6 菌株L-2 发酵液对细菌的抑制作用

表7 菌株L-2 发酵液对真菌的抑制作用

3 结论

本研究从鸡肠道中筛选出具有较强产酸能力的菌株L-2，经生理生化反应和16S rDNA 序列分析鉴定为植物乳杆菌，经高效液相色谱分析发现，菌株L-2 发酵液中可产生乳酸、乙酸和柠檬酸等有机酸， 通过打孔法测定L-2 菌株的抑菌作用，菌株L-2 发酵液对三种食源性致病细菌均表现出很好的抑菌效果， 且对大肠杆菌的抑制效果最为显著，说明菌株L-2 发酵液中存在抑制细菌成分，该结果与其他文献报道（孙杰，2020；李卫娜，2019；杨雪梅，2011）研究结果基本一致。菌株L-2发酵液对尖孢镰孢菌等真菌也具有抑制性， 抑菌圈直径均超过14 mm，该结果与Cheong （2014）发现，12 株植物乳杆菌具有抑制真菌活性结果一致。Magnusson（2003）对1200 株乳酸菌进行研究，发现其中几株植物乳杆菌对真菌具有强抑制活性。 菌株L-2 能够产生乳酸、乙酸等有机酸，破坏病原菌细胞膜结构，从而产生抑菌作用，这与Yin等（2020）发现，植物乳杆菌DY-6 的主要抑菌物质为乳酸、乙酸等报道一致。本研究筛选出的乳酸菌L-2 可对进一步开发抑菌微生态制剂用于畜禽类疾病防控提供一定基础。