高产角蛋白酶弯曲假单胞菌的筛选鉴定、发酵条件优化及酶学性质

谢晨杰， 宋超东， 谭柄福， 杨登峰， 申乃坤， 姜明国， 张红岩

（1.广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，广西海洋微生物资源产业化工程技术研究中心，广西 南宁 530008；2.广西科学院北部湾海洋研究中心，广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室，广西 南宁 530007）

近年来，全球家禽养殖产业迅猛发展，每年可产生数百万吨的羽毛（Li，2019）。如此巨大数量的废弃羽毛如果采用填埋或焚烧等方法处理， 不仅会造成土壤、 空气等的污染， 还会传播疾病（Cedrola 等，2012；Sarkar 等，2012；Agrahari 等，2010；Saber 等，2010）。然而羽毛废弃物是自然界中蛋白质含量最高的资源之一，其中β-角蛋白含量约占85%（Li 等，2020）。但角蛋白分子中含有大量相互交联的二硫键、氢键等化学键，其结构复杂，不易被降解（Li 等，2020；Callegaro 等，2018）。 因此，羽毛废弃物需要处理后才能应用。目前采用的物理、化学等方法在降解羽毛的过程中存在污染环境、成本高等问题， 同时还会破坏羽毛中的一些必需氨基酸（张荣等，2020；Cascarosa 等，2012） 。 而利用微生物降解废弃羽毛， 不仅能改善环境污染等问题， 也能将羽毛废弃物转化为大量氨基酸应用于饲料、肥料等行业（张荣等，2020），是一种绿色经济的方法（Deniz 等，2021；Sharma 等，2018）。

目前已发现多种微生物能分泌角蛋白酶降解羽毛，包括真菌、放线菌和细菌（Gurav 等，2020；Jaouadi 等，2015；Habbeche 等，2014）。产角蛋白酶的真菌有镰刀菌属、曲霉属等。 如Aspergillussp.DHE7 表现出了很高的角蛋白酶活性（El-Ghonemy 等，2021）。 但真菌多为致病菌，商业价值较小（杨连等，2015）。放线菌中可分泌角蛋白酶的菌株多为链霉菌属， 该属菌除可分泌角蛋白酶降解废弃羽毛外，还能利用菌丝缠绕在羽毛上，对羽毛有一定的机械破坏力， 使羽毛能够更快更好地完成降解，但放线菌存在生长周期长、酶活较低等问题（Li 等，2020）。 与真菌和放线菌相比，细菌的生长周期短、发酵时间短、产角蛋白酶活性高，因此对细菌角蛋白酶的研究一直是国内外的热点话题（Jaouadi 等，2015）。 目前发现产角蛋白酶的细菌多为芽孢杆菌。 如BacillusparamycoidesGxun-30（张妮等，2020）、Bacillussp.NKSP-7 （Akram 等，2020）、Bacillussp.NDS-10（Akram 等，2021）等都能分泌角蛋白酶，且具有较高的羽毛降解能力。除此之外， 产角蛋白酶的细菌还有Pseudomonas aeruginosaGxun-7 （杨梦莹等，2022）、Serratia marcescens（耿芳等，2018）、Caldicoprobacter guelmensis（Bouacem 等，2015）等。 角蛋白酶除了可以降解角蛋白外，还可用于牲畜饲料、生物医学、皮革、纺织、洗涤及环保等工业（Nnolim 等，2020；Brandelli 等，2015；Brandelli 等，2010）。因此，寻找高效的角蛋白酶分泌菌株是目前研究热点之一（Akram 等，2020）。但目前分泌角蛋白酶的菌株存在降解效果差、酶活低、抗逆性差等问题，急需寻找可高产角蛋白酶且抗逆性强的菌株。

目前陆地微生物资源的挖掘日益困难，而海洋微生物资源不仅丰富而且开发程度低 （张妮等，2020）。 所以本研究在前期已从海洋环境筛选出大量可产角蛋白酶菌株的基础上，进一步从广西北部湾某海鸭养殖基地取样， 分离高效降解羽毛的菌株，并对菌株发酵条件及酶学性质进行研究，最后对羽毛降解液中游离氨基酸组成及含量进行分析。

1 材料和方法

1.1 材料 采集广西北部湾海鸭养殖基地滩涂沙、羽毛等样品，装入自封袋中低温带回实验室并储存于4 ℃（文冰洁，2018）。鸡羽毛收集于家禽屠宰场，用自来水冲洗去除杂质，随后烘干至衡重，最后将羽毛剪成1 ～2 cm 的小段，保存在密封袋中备用（Wang 等，2017）。

1.2 主要试剂与仪器 干酪素、福林酚、三氯乙酸等均为国产分析纯。 GelDoc XR BI0-RAD 凝胶电泳成像分析仪， 北京科誉兴业科技发展有限公司；L-8900 全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司；Tgradient 型多功能梯度PCR 仪，德国Biometra公司；Regulus 8100 场发射扫描电子显微镜，日立高新技术公司。

1.3 培养基 富集培养基、初筛培养基、羽毛发酵培养基等配制参考李志伟 （2020）、 东秀珠等（2001）的方法进行。

1.4 菌株的筛选

1.4.1 富集 8 g 样品土壤加入到20 mL 的无菌水中，放入摇床充分混合30 min，取上清接种于富集培养基。 180 r/min 摇床37 ℃培养2 d。

1.4.2 初筛 将富集培养液按10-1～10-7梯度稀释后，涂布于初筛培养基，30 ℃倒置培养。 挑选透明圈大的菌株进行划线纯化， 并计算透明圈直径与菌落直径的比值。

1.4.3 复筛 将上述透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株接种于20 mL 的LB 肉汤培养基中，30 ℃，200 r/min 的摇床培养12 h 制备种子液。 种子液按照2%（V/V） 的接种量接种到羽毛发酵培养基中，30 ℃，200 r/min 发酵培养48 h。发酵液上清即为粗酶液，取样测定其酶活，根据羽毛降解效果和酶活大小进行复筛。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 形态与生理生化特征鉴定 观察培养基平板上的菌落形态特征。 革兰氏染色后在光学显微镜下观察菌体形态。 在扫描电子显微镜下观察菌体形态及大小。 参照《常见细菌系统鉴定手册》对该菌进行生理生化鉴定（刘晓迪等，2012）。

1.5.2 16S rDNA 鉴定 按照杨梦莹等（2022）的方法进行16S rDNA 鉴定，确定菌株的分类地位。

1.6 菌株的产酶条件

1.6.1 角蛋白酶酶活测定 参考张妮等（2020）的方法进行酶活测定。 把50 ℃时1 min 催化酪蛋白生成1 μg 酪氨酸所需要的酶量定义为1 个酶活单位（U）。

1.6.2 产酶条件优化 在初始发酵培养基及培养条件 （羽毛10 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO41.4 g/L，MgSO40.1 g/L，KH2PO40.7 g/L， 初始pH 7.0，30 ℃，200 r/min，接种量2%，装液量50/250 mL，发酵时间48 h）下采用单因素试验探究菌株产酶的最适羽毛含量 （0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，m/V）、最佳碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、木薯粉、可溶性淀粉）、最佳碳源浓度（10、20、30、40、50 g/L）、最适氮源（玉米浆、酪蛋白、酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、尿素）、最适pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）。 每组试验进行三次，结果取平均值。

根据单因素试验结果选出对产角蛋白酶有显著影响的4 个因素，进行四因素三水平L9（34）的正交优化试验。 以角蛋白酶酶活（U/mL）作为响应值，确定发酵条件的最优组合，并对最优组合进行验证。

1.7 粗酶液的酶学性质 采用单因素试验探究菌株所产角蛋白酶的最适作用条件。 按照上文提到的方法制备粗酶液应用于下述试验。 粗酶液与酪蛋白底物反应后通过测定角蛋白酶的活性判断角蛋白酶的最适作用条件。

1.7.1 酶的最适作用温度 酶与底物在不同温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）下反应10 min。

1.7.2 酶的温度稳定性 粗酶液于不同温度（40、50、60、70、80、90 ℃）下水浴10 min 后与底物反应。

1.7.3 酶的最适pH 用pH 分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的Tris-HCl 缓冲液和pH 为9.0的Gly-NaOH 缓冲液稀释粗酶液后与底物反应。

1.7.4 化学试剂对酶活性的影响 用pH 为7.5 的Tris-HCl 缓冲液配制相同浓度的乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS、PMSF、β-巯基乙醇、 二甲基亚砜（DMSO）和异丙醇，分别加入到粗酶液中与底物反应。 并用pH 为7.5 的Tris-HCl 缓冲液作为空白对照。

1.7.5 金属离子对酶活性的影响 用pH 为7.5的Tris-HCl 缓冲液配制不同浓度（0.05、0.5、5 mmol/L）的金属离子溶液（NaCl、KCl、SrCl2、MnCl2、CaCl2、CoCl2、MgCl2、CuCl2、AlCl3）， 然后分别稀释粗酶液后与底物反应。 用pH 为7.5 的Tris-HCl缓冲液作空白对照。

1.7.6 酶的底物特异性 分别选择人的头发、鸡的羽毛、鸡羽毛粉、角蛋白、酪蛋白和牛血清作为底物， 用pH 为7.5 的Tris-HCl 缓冲液将上述底物配制成2%的浓度 （不溶性的底物进行粉碎处理），然后与粗酶液进行反应。

1.7.7 测定酶的动力学性质 用pH 为7.5 的Tris-HCl 缓冲液配制浓度分别为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%（m/V）的最适底物溶液，然后与经适当稀释后的粗酶液混合， 在其最适温度下分别反应10 min， 测定角蛋白酶活性。 根据Lineweaver-Burk 双倒数作图法作1/V0-1/[S] 图，计算Km值和Vmax值。

1.8 羽毛降解产物的游离氨基酸分析 用5%的磺基水杨酸按1：5 的比例沉淀羽毛降解液2 h，4 ℃、12000 r/min 离心20 min， 收集上清液并用0.2 μm 的膜滤器过滤， 采用L-8900 全自动氨基酸分析仪进行检测。

1.9 数据处理与分析 用SPSS 21.0 和Graph-Pad Prism 8 进行试验数据处理，用Mega 7.0 构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选 将经过富集和稀释的富集培养基涂布于初筛培养基上， 从中挑选出现透明圈的菌落划线培养，共分离得到75 株产生透明圈的菌株（图1A）。将这些菌株的种子液接种到羽毛发酵培养基中培养，其中有56 株菌对羽毛有较好的降解效果，随后测定发酵上清的角蛋白酶酶活，挑选出酶活较高的菌株。最终选定15 号菌进行后续试验， 并将该菌命名为Gxun-15。 该菌能在发酵48 h 后，将培养基中1%（m/V）的羽毛降解80%以上（图1B），酶活可达202.35 U/mL。

图1 菌株的筛选

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株形态学及生理生化特性 Gxun-15 菌落在酪蛋白平板上呈浅黄色，菌落凸起，边缘较光滑（图2A）。Gxun-15 为革兰氏阴性菌（图2B）。扫描电镜观察菌体呈杆状（图2C）。

图2 Gxun-15 的形态特征

菌株生理生化试验中鉴定结果表明， 硫化氢试验结果为阳性，其余V-P、硝酸盐还原、甲基红等结果均为阴性（表1）。 根据菌株形态特征和生理生化试验结果，将Gxun-15 初步鉴定为假单胞菌属菌株（Pseudomonnasspp.）。

表1 Gxun-15 的生理生化特征

2.2.2 菌株的分子鉴定 将菌株Gxun-15 的16S rDNA 测序后，在EZ BioCloud 上进行相似性比对，结果显示，Gxun-15 菌株基因序列与弯曲假单胞菌（Pseudomonas geniculata）ATCC19374 同源性最高，为99.51%。 将Gxun-15 的16S rDNA 序列提交到NCBI，获得的GenBank 登录号为OP975708。 进一步构建系统发育树结果显示Gxun-15 为弯曲假单胞菌（P.geniculata）（图3）。根据菌株形态特征、生理生化特征以及16S rDNA 序列鉴定结果，最终将该菌命名为P.geniculataGxun-15。

图3 菌株Gxun-15 基于16S rDNA 基因序列构建的系统发育树

2.3 菌株发酵条件优化结果

2.3.1 单因素优化结果 当羽毛浓度较低时，酶活随羽毛含量增加而增大， 但当浓度高于3.0%（m/V）时，酶活反而下降。 羽毛含量为3%（m/V）时，酶活达到最高，为294.01 U/mL，因此，该菌株的最佳羽毛添加量为3%（m/V）（图4A）。 与对照相比，添加葡萄糖、蔗糖、木薯粉、可溶性淀粉为碳源时，均能显著（P＜0.05）提高角蛋白酶活，其中添加蔗糖时酶活最高，为275.62 U/mL（图4B）。进一步优化蔗糖浓度， 其最适添加量为40 g/L，酶活可达331.68 U/mL（图4C）。氮源优化结果表明，与其他氮源相比，添加酪蛋白时菌株产酶活性最高，为245.50 U/mL（图4D）。 虽然添加玉米浆或硫酸铵与添加酪蛋白酶活差异不显著 （P＞0.05），但添加酪蛋白时羽毛降解效果更好，所以最优氮源为酪蛋白。 最后对菌株发酵初始pH 进了优化，当pH 为7.5 ～9.0 时菌株降解羽毛效果较好， 酶活相对较高且趋于平稳， 因此最适pH为7.5 ～9.0（图4E）。

图4 Gxun-15 产酶条件的单因素优化

2.3.2 正交试验优化Gxun-15 的最佳产酶条件根据上述单因素结果，选取羽毛、酪蛋白、蔗糖、初始pH 这4 个对酶活影响较大的因素进行正交优化试验（表2）。 由正交试验和方差分析的结果（表3、表4）可知，4 个因素对菌株产酶的影响均为极显著（P＜0.01），主次顺序为羽毛浓度（A）＞初始pH（D）＞碳源（C）＞氮源（B）。 最优组合方案为A2B1C3D1，即羽毛浓度2.5%（m/V），酪蛋白浓度1 g/L，蔗糖浓度40 g/L，初始pH 7.5。 在确定最优组合下进行3 个平行验证试验，平均酶活为（674.39±5.81）U/mL，与预测值相符，验证了正交试验的正确性。 与初始酶活（202.35 U/mL）相比，优化后酶活提高了3.3 倍。

表2 正交试验因素水平设计

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析

2.4 角蛋白酶粗酶液的酶学性质

2.4.1 Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液的最适作用温度 粗酶液反应温度在30 ～60 ℃时， 酶活随温度的升高而增大；但在60 ～90 ℃时，酶活随温度增高而减小；当反应温度为60 ℃时，酶活最高可达642.63 U/mL。 因此，该酶的最适作用温度为60 ℃（图5）。

图5 粗酶液的最适作用温度

2.4.2 Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液的温度稳定性 粗酶液经不同温度处理后，酶活均下降。在50 ℃以下其酶活性下降相对缓慢， 即低温对酶的破坏性较弱；在50 ～60 ℃时，酶活性下降最快，60 ℃时相对酶活性低于20%；90 ℃时相对酶活性降到10%以下，可见高温对酶的破坏性较大（图6）。

图6 粗酶液的温度稳定性

2.4.3 Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液的最适作用pH Gxun-15 所产粗酶液在pH 为5.5 ～6.5 时，酶活性随pH 的增大而增大； 在pH 为6.5 ～8.0时，酶活性相对稳定；但当pH 超过8.0 时，酶活性下降迅速（图7）。 因此，该角蛋白酶的最适pH 为6.5 ～8.0。

图7 粗酶液的最适作用pH

2.4.4 化学试剂对Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液活性的影响 化学试剂中β-巯基乙醇对酶活具有极显著促进效果（P＜0.01），可使酶活提高5倍。EDTA、DMSO 和异丙醇对酶活几乎无影响。但SDS 和PMSF 能够抑制角蛋白酶酶活， 其中添加PMSF 的相对酶活性仅为34.49%， 由此可知该角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶（图8）。

2.4.5 金属离子对Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液活性的影响 Na+、Mg2+、K+从离子浓度0.05 ～5 mmol/L逐渐抑制酶活。 Mn2+从离子浓度0.05 ～5 mmol/L逐渐促进酶活，当Mn2+浓度为5 mmol/L 时，促进效果最明显，相对酶活达到192.18%。 Sr2+在浓度为0.05 mmol/L 时对酶活性无影响， 但当浓度达到0.5 mmol/L 时，对酶活有促进作用，浓度进一步增大到5 mmol/L，促进作用减弱。 Al3+和Cu2+对酶活的抑制效果极显著（P＜0.01）。添加了离子浓度为5 mmol/L 的Al3+和Cu2+的相对酶活分别为9.70%和13.47%（表5）。

表5 金属离子对Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液活性的影响（相对活性）%

2.4.6 Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液的底物特异性 图9 的底物特异性结果表明，Gxun-15 所产粗酶液对可溶性底物和不可溶性底物均具有一定的降解能力，其中对酪蛋白的降解能力最好，对角蛋白的降解能力次之。 以角蛋白为底物的酶活超过了酪蛋白酶活的1/2， 符合角蛋白酶的定义（Gurav 等，2020）。 以羽毛为底物的酶活低于羽毛粉，可能是酶与羽毛底物的接触面积小于羽毛粉，反应不充分。 该酶对头发、羽毛的降解能力较弱，原因可能是二者均为固体不溶物。 牛血清作为可溶性底物，酶对它的降解能力比对酪蛋白低很多，说明该酶对酪蛋白有一定的底物专一性， 且专一性很强。

图9 粗酶液的底物特异性

2.4.7 Gxun-15 所产角蛋白酶粗酶液的动力学性质 以酪蛋白为底物测其酶动力学常数， 得酶动力学公式为y=0.02558x+7.669， 线性相关系数为R2=0.9850，Km值为0.003 g/mL，Vmax值为0.130 mg/mL·min。 Km值比较小，说明Gxun-15 分泌的角蛋白酶对酪蛋白底物具有良好的匹配性， 酶液的催化速率较高（图10）。

图10 粗酶液的动力学性质

2.5 羽毛降解产物的游离氨基酸分析 Gxun-15的羽毛降解液中共检测到16 种游离氨基酸，总含量达到221.24 mg/L， 远高于目前文献报道的GRK（表6）。 16 种氨基酸中有7 种为必需氨基酸， 必需氨基酸总量占游离氨基酸总量的70.34%， 其中苯丙氨酸含量最高为118.36 mg/L。而对照组游离氨基酸总共有9 种， 总含量仅有16.56 mg/L。

表6 羽毛降解产物游离氨基酸成分mg/L

3 讨论与结论

本研究从广西北部湾海鸭养殖基地取样，筛选出了一株高效羽毛降解菌株， 经鉴定为P.geniculataGxun-15。 该菌株在降解尼古丁（Liu等，2014）， 维持植物根部离子平衡 （Singh 等，2020），促进植物生长（Gopalakrishnan 等，2015）等方面有相关研究， 但目前鲜见关于弯曲假单胞菌在羽毛降解方面的研究报道。

Gxun-15 经培养基优化最佳羽毛添加量为2.5%（m/V）， 高于菌株B.aryabhattaiS-2 报道的1%（m/V）（倪维敏等，2022），说明该菌具有较好的羽毛降解能力；其最佳碳源为40 g/L 蔗糖，这与菌株B.subtilisA1-2 不同（闫志宇等，2015），说明不同菌株具有不同的碳源需求。 在羽毛降解过程中，随着羽毛的降解，会释放出氨，羽毛培养基的pH 会进一步上升。 而菌株Gxun-15 产角蛋白酶的能力在初始pH 为弱碱性环境（pH 7.5）时较强。由此可见，Gxun-15 在发酵过程中能更好地适应pH 较为波动的发酵环境，具有较好的工业应用潜力，这与报道的B.subtilisA1-2 菌株类似（闫志宇等，2015）。 菌株Gxun-15 优化后酶活力可达674.39 U/mL，较优化前的酶活（202.35 U/mL）提高了3.3 倍，高于许多其他报道菌株酶活性，如B.tropicusGxun-17（112.57 U/mL）（Shen 等，2022）、B.pumilusJYL（57.14 U/mL）（Sun 等，2020）。

角蛋白酶的作用温度与来源微生物的生存环境有关， 多数微生物来源的角蛋白酶最适温度为30 ～80 ℃，最适pH 为7.5 ～9.0。Gxun-15 所产角蛋白酶的最适作用温度为60 ℃，与目前一些报道类似 （Shen 等，2022；Sun 等，2020； 闫志宇等，2015）， 但低于异常嗜热分泌角蛋白酶最适温度（100 ℃）（Nam 等，2002） ， 而高于Chrysosporium indicum分泌角蛋白酶的最适温度 （35 ℃）（Sharma 等，2016） 。 Gxun-15 所产角蛋白酶的最适pH为6.5 ～8.0， 这与目前多数细菌分泌角蛋白酶相同， 但低于Nocardiopsissp.TOA-1 角蛋白酶的最适pH（12.5）（Mitsuiki 等，2004），高于Chrysosporium indicum最适pH（3）（Sharma 等，2016） 。 化学试剂β-巯基乙醇可使酶活提高5 倍，可能是因为β-巯基乙醇具有很强的还原性，能够促进羽毛角蛋白中二硫键的断裂，进而提高角蛋白酶活，这与报道B.coagulansX3（雷平等，2022）相一致。 来源于微生物的角蛋白酶绝大多数为丝氨酸蛋白酶。PMSF 对该菌所产角蛋白酶有明显的抑制作用，可知该角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶， 与Bacillussp.RCM-SSR-102（Pintubala 等，2020）等菌株的报道相似。 以上结果表明菌株Gxun-15 分泌的角蛋白酶具有较好的化学试剂稳定性， 在多种工业领域具有较好的应用前景。

据报道， 利用Bacillus pumilusGRK 降解羽毛，游离氨基酸含量仅有60.74 mg/L（Reddy 等，2017），而利用Gxun-15 降解，游离氨基酸总含量达到221.24 mg/L，是GRK 的3.6 倍。 且Gxun-15的羽毛降解产物中多为必需氨基酸， 主要氨基酸为苯丙氨酸、甲硫氨酸等，而GRK 的羽毛降解产物中异亮氨酸和赖氨酸相对含量较多。由此可见，不同微生物所产角蛋白酶对羽毛角蛋白的作用位点不同。 利用Gxun-15 降解羽毛，其降解产物中氨基酸含量丰富， 种类多， 在氨基酸有机肥（Sun等，2020）和动物饲料蛋白产品开发（Li，2019）方面有巨大潜力。

因此，海洋来源的P.geniculataGxun-15 具有高效的羽毛降解能力， 其羽毛降解产物中富含多种氨基酸。该菌分泌的角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，具有良好的化学试剂稳定性。 本研究为今后的羽毛废弃物处理提供了新的菌种资源， 并且该菌在饲料、氨基酸肥料等方面具有良好的应用前景。