蒲公英中绿原酸的提取工艺优化及稳定性研究

刘军海 ， 苗侨伟， 何 敏

（1.陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001；2.陕西理工大学陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723001）

蒲公英又名婆婆丁， 是菊科多年生草本植物，广泛生于山坡草地、路边、田野、河滩（刘光武，2022；刘晓燕，2022）。 蒲公英营养成分丰富，可作为野生蔬菜食用， 也是一味重要的临床常用草药（秦聪聪，2022），主要含有黄酮类、多糖类、色素类、有机酸类物质（赵欣，2022）。 其资源丰富，来源广泛，价格低廉，其中酚酸类物质种类丰富，尤其是蒲公英叶中绿原酸含量较高（冯戏雨，2019），临床报道其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖和免疫调节等多方面的药理作用 （高林晓，2022；Bagdas，2020；Naveed，2018；Li，2010）。 近年来，蒲公英在食品、药品、化妆品等领域的研究也在不断深入，随着国家禁止在饲料中添加抗生素类药物等相关政策的发布，寻找天然来源、低毒低残留、成本低廉的抗生素类产品已成为目前畜牧养殖中的重点（刘静慧，2020）。

本研究以陕西汉中野生蒲公英为原料， 采用超声波辅助醇水溶液提取绿原酸， 以绿原酸得率为考察指标，在单因素试验的基础上，设计正交试验，探究绿原酸提取的最佳条件，并对所得绿原酸提取液进行体外抗氧化活性探究及稳定性研究，旨在为蒲公英开发成安全稳定的功能性饲料提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 蒲公英（陕西汉中野生）；无水乙醇（AR， 利安隆博华有限公司）； 维生素C 片（AR，四川依科制药有限公司）；无水碳酸钠（AR，成都市科龙化工试剂厂）；氯化钠（AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）；葡萄糖（AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）；硫酸铜（AR，天津博迪化工股份有限公司）；硫酸锌（AR，天津市大茂化学试剂厂）；硫酸亚铁（AR，天津市大茂化学试剂厂）；硫酸铁（AR，天津市大茂化学试剂厂）；山梨糖醇（食品级，寿光市华力糖醇有限公司）；焦亚硫酸钠（食品级， 恒亿化工有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（≥98%，阜阳生物技术有限公司）；双氧水（AR，西安龙泰化工材料有限公司）；绿原酸标准品（AR，南京源植生物科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器 LD5-10 低速离心机（北京京立离心机有限公司）；TU-1900 型双光束紫外可见分光光度计 （济宁市裕泽工业科技有限公司）；GW1030 超声波清洗机型（深圳市冠博科技实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 绿原酸标准曲线的绘制 准确称取5.5 mg的绿原酸标准品于小烧杯中，加入适量无水乙醇，超声辅助至完全溶解后转移至100 mL 容量瓶中， 用无水乙醇定容至刻度线作为绿原酸标准品溶液。 经双光束紫外可见分光光度计测定绿原酸标准液的最大吸收波长为326 nm，分别移取绿原酸标准溶液1、3、5、7、9 mL 于10 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容后静置15 min。 使用无水乙醇作为空白对照组在326 nm 处测定其吸光度， 每组平行测定3 次，求取平均值。以绿原酸标准液的吸光度A 为纵坐标，以绿原酸标准液的浓度C 为横坐标，做出C-A 关系图。

1.2.2 绿原酸的提取及测定 将蒲公英全草洗净，放入烘箱干燥至恒重， 用中草药粉碎机粉碎后过50 目筛网得蒲公英全草粉末， 放入棕色磨口瓶中备用。准确称取蒲公英全草粉末1.00 g 于干燥试管中，按照料液比为1:14（g/mL）加入体积分数为50%的乙醇水溶液， 摇匀后在60 ℃条件下放入600 W超声波清洗机超声辅助提取1 h， 将试管中的液体移入离心管设置转速（3000 r/min）离心20 min 后减压抽滤并量取上层清液体积并记录。 移取1 mL清液稀释50 倍后在326 nm 处测定其吸光度，根据1.2.1中所得线性方程求出提取液浓度。 以绿原酸标准品为对照品，计算蒲公英中绿原酸的提取率。

式中：C 为超声后的提取液浓度，μg/mL；V为离心后的上层清液的体积，mL；n 为稀释倍数；m 为称取的蒲公英叶粉末的质量，g。

1.2.3 绿原酸提取的单因素试验设计

1.2.3.1 提取料液比的筛选用50%的乙醇水溶液为提取溶剂， 分别设置料液比1:11、1:12、1:13、1:14、1:15（g/mL），按照“1.2.2”的方法条件进行提取， 探究不同提取料液比对蒲公英绿原酸得率的影响。

1.2.3.2 提取时间的筛选 分别设置提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h，按照“1.2.2”的方法条件进行提取，探究不同提取时间对蒲公英绿原酸得率的影响。

1.2.3.3 提取溶剂体积分数的筛选 分别配制体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液作为提取溶剂，按照“1.2.2”的方法条件进行提取， 探究不同提取溶剂体积分数对蒲公英绿原酸得率的影响。

1.2.3.4 提取温度的筛选 分别设置温度为40、50、60、70、80 ℃，按照“1.2.2”的方法条件进行提取，探究不同提取温度对蒲公英绿原酸得率的影响。

1.2.4 正交试验设计 以提取料液比（A），提取时间（B），提取溶剂体积分数（C），提取温度(D)为主要影响因素，空白列（E）为误差列，以绿原酸得率为考察指标，进行L16（45）正交试验，试验因素与水平见表1。

表1 L16（45) 正交试验因素水平

1.2.5 体外抗氧化性检测分析

1.2.5.1 DPPH 自由基清除法准确称取DPPH 4.5 mg 于烧杯中，加入50%的乙醇水溶液使其充分溶解，转移至25 mL 容量瓶中定容，该溶液现配现用，密封避光保存。 将绿原酸提取液和维生素C 分别稀释配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL系列的溶液。在10 mL 试管中分别加入2.0 mL 绿原酸提取液，2 mL DPPH 溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混匀，用1 cm 的比色皿在517 nm 波长处测定吸光度，记为Ai；再放入柜子避光保存0.5 h后再次测量吸光度，记为Aj；对照组试验只加2 mL的DPPH 溶液，再加4 mL 的50%乙醇溶液，其吸光度记为AC（参比溶液为50%乙醇溶液）。每个样品测定三次，求取平均值。 在同等条件下，测定维生素C 对DPPH 清除的能力（马萌，2022）。

1.2.5.2 羟基自由基清除法 准确称取H2O2试剂4.5 mg 于烧杯中， 将其转入50 mL 容量瓶中，用50%乙醇水溶液定容，备用。 将绿原酸提取液和维生素C 分别稀释配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL 系列的溶液。 在10 mL 试管中分别加入2.0 mL 绿原酸提取液，2 mL H2O2溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混匀，然后用1 cm 的比色皿在326 nm 波长处测定吸光度，记为Ai；再放入柜子避光保存0.5 h 后再次测量吸光度，记为Aj；对照组试验只加2 mL 的H2O2溶液， 再加4 mL的50%乙醇溶液，其吸光度记为AC（参比溶液为50%乙醇溶液）。每个样品测定三次，求取平均值。在同等条件下，测定维生素C 对H2O2羟基自由基清除的能力（王凯，2021）。

1.2.6 稳定性研究

1.2.6.1 金属盐离子对于绿原酸稳定性的影响分别取7 份10 mL 绿原酸提取液于50 mL 烧杯中，向其中6 个烧杯分别加入1.00 g 的不同金属盐Na+（a）、K+（b）、Zn2+（c）、Cu2+（d）、Fe2+（e）、Fe3+（f），剩余一个作为空白对照。

1.2.6.2 pH 对于绿原酸稳定性的影响分别取7 份10 mL 绿原酸提取液于50 mL 烧杯中， 用1 mol/L 的稀硫酸和无水碳酸钠分别调节其pH，将pH 为7 作为空白对照，检测并记录其吸光度。

1.2.6.3 食品添加剂对于绿原酸稳定性的影响分别取4 份10 mL 绿原酸提取液于50 mL 烧杯中，分别向其中3 个烧杯中加入1.00 g 不同的食品添加剂，剩余一个空白对照，检测并记录其吸光度。

2 结果与分析

2.1 绿原酸的标准曲线 由图1 可以看出， 吸光度与质量浓度呈线性关系， 得出方程式为y=0.07965x+0.04055，R2=0.9998，表明线性关系良好。

图1 绿原酸标准液C-A 关系图

2.2 绿原酸提取的单因素试验结果

2.2.1 提取料液比对蒲公英绿原酸得率的影响由图2 可以看出，随着提取料液比的增加，绿原酸的提取率先增大后减小。 当提取料液比为1:14（g/mL）时，蒲公英中绿原酸的提取量达到最大值。 而出现提取率先增大后减小的趋势可能是因为当提取溶剂较少时，蒲公英中的绿原酸没有完全浸出，而当提取溶剂过大时， 蒲公英中的其他活性物质例如黄酮、色素等也被浸出，造成绿原酸提取率略有减小。料液比增大会造成溶剂用量大，生产成本高而且影响后续对于蒲公英绿原酸提取液中绿原酸含量的测定与判断。综上所述，初步选择的料液比水平为1:14（g/mL）。

图2 提取料液比对绿原酸得率的影响

2.2.2 提取时间对蒲公英绿原酸得率的影响由图3 可以看出，随着提取时间的增加，绿原酸的提取率呈现先增大后减小的过程，可以直观看出，绿原酸提取率与提取时间之间的关系有一个峰值，即超声振荡时间为1.5 h 时，绿原酸提取率达到最高。 而出现提取率先增大后减小的趋势可能是当提取时间小于1.5 h 时， 蒲公英中绿原酸未完全浸出， 当提取时间大于1.5 h 时绿原酸含量有所减小可能是因为超声时间较长导致绿原酸结构发生变化或者是其他活性物质如黄酮、 色素等浸出量增大，造成绿原酸提取率略有减小。综上所述，此次试验控制了其他因素的影响，极大增强了试验结果的可信度， 初步选择超声提取时间水平为1.5 h。

图3 提取时间对绿原酸得率的影响

2.2.3 提取溶剂体积分数对蒲公英绿原酸得率的影响 由图4 可知， 随着提取溶剂体积分数的增加， 蒲公英中绿原酸的提取率会呈现先增加后减小的趋势。 可以直观看出当乙醇的体积分数达到50%时，蒲公英中绿原酸的提取率达到峰值。而出现提取率先增大后减小的趋势可能是提取溶剂体积分数过大时蒲公英中一些脂溶性物质会被乙醇溶液大量浸出， 相当于给蒲公英中的绿原酸添加了一部分杂质，即会影响绿原酸的测定。另一方面可能是因为当乙醇的体积分数过大导致绿原酸中某些有效成分的变性失活， 破坏了绿原酸的原本结构，降低了从蒲公英中提取绿原酸的提取率。提取溶剂体积分数大成本高且不利于后期处理，综上所述，初步选择提取溶剂为体积分数为50%的乙醇水溶液。

图4 提取溶剂体积分数对绿原酸得率的影响

2.2.4 提取温度对蒲公英绿原酸得率的影响 由图5 可知，随着提取温度的增加，蒲公英中绿原酸的提取率会呈现先增加后减小的趋势。 可以直观看出当提取温度为60 ℃时，蒲公英中绿原酸的提取率达到峰值。 而出现提取率先增大后减小的趋势可能是在一定范围内升高温度有助于提升分子扩散速率，从而增大提取率，但是当温度过高时可能会增加其他杂质的浸出率或者导致绿原酸变性。 综上所述，在保证提取率的前提下，初步选择提取温度为60 ℃。

图5 提取温度对绿原酸得率的影响

2.3 正交试验结果 根据控制单因素变量可知，主要影响蒲公英中绿原酸提取率的因素有料液比（A），超声振荡温度（B），乙醇的体积分数（C），超声振荡时间（D），选择这四个影响因素的四个最佳水平，采用L16（45）正交表设计试验，以蒲公英中绿原酸提取率为指标进行考察。 正交试验结果的极差分析如表2 所示， 正交试验结果的方差分析如表3 所示。由表2 可以看出，蒲公英中绿原酸提取的最佳工艺条件为A1B3C2D4，即料液比为1:12（g/mL），提取温度为60 ℃，提取时间为1.5 h，提取溶剂体积分数为50%。 按此条件进行3 次验证试验， 取平均值， 得到蒲公英中绿原酸得率为3.18%。 由表3 可知，四个提取因素中，料液比、提取温度、体积分数对绿原酸的提取影响均不显著，而提取时间对绿原酸的提取影响非常显著。因此，实际生产过程中可适当减少料液比， 降低提取温度，减小体积分数，以降低生产成本。 但要严格控制提取时间，以保证较高的绿原酸提取率。

表2 正交试验结果极差分析

表3 正交试验方差分析表

2.4 绿原酸体外抗氧化性研究结果

2.4.1 绿原酸提取液对DPPH 自由基的清除能力由图6 可知， 绿原酸提取液和VC 对于DPPH 自由基的消除能力趋势是随着浓度的增加而不断增加的。 当浓度达到0.6 μg/mL 时，绿原酸提取液对DPPH 自由基消除能力达到最大值，为80%。绿原酸提取液和VC 对DPPH 自由基均有良好的清除能力，表明绿原酸具有良好的抗氧化能力，相同浓度下对于DPPH 自由基的清除能力略低于VC。

图6 绿原酸提取液和VC 对DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 绿原酸提取液对于羟基自由基的清除能力由图7 可知， 绿原酸提取液对于羟基自由基具有很强的清除能力， 且随着样品浓度增加其对羟基自由基清除作用加强，当浓度达到0.6 μg/mL 时，绿原酸提取液对双氧水中羟基自由基消除能力达到最大值，为79%。 在相同浓度下，绿原酸提取液对羟基自由基清除能力均高于VC 溶液， 说明绿原酸抗氧化活性高于VC 溶液。

图7 绿原酸提取液和VC 对羟基自由基的清除作用

2.5 稳定性研究结果

2.5.1 金属盐离子对于绿原酸稳定性的影响 由图8 可知，Zn2+、Na+对于绿原酸提取液中绿原酸影响不显著，Fe2+和Fe3+会有一定的促进作用， 促进绿原酸提取液中绿原酸的含量增长； 可能是因为铁离子与蒲公英绿原酸提取液中的一些杂质离子发生反应， 所以显示绿原酸提取液中添加铁离子之后对于绿原酸的含量增加有着促进作用。 而Cu2+对于绿原酸的含量有很大的抑制作用， 可能是因为铜离子更容易与蒲公英绿原酸提取液中的绿原酸发生反应， 导致蒲公英绿原酸提取液中绿原酸浓度的降低， 故蒲公英绿原酸提取液的保存应该要避免使用铜制品保存， 更不应该与铜制品接触，防止绿原酸含量减少导致的活性低下，生理活性不强等问题。

图8 金属离子对绿原酸提取液稳定性影响

2.5.2 pH 对于绿原酸稳定性的影响 由图9 可知，绿原酸在偏酸性环境中稳定性比较强，但是酸性强度太大也会导致绿原酸含量降低， 可能是绿原酸结构被破坏导致含量降低。 而且绿原酸不适合在pH 大于7 的碱性溶液中反应， 保存在碱性环境中会导致原有的绿原酸含量减小，可能是pH过大导致蒲公英提取液中绿原酸某些化学键的断裂重组。 综上所述与pH=7 的中性溶液相比，偏酸性环境比较适合绿原酸的存放， 碱性环境并不适合绿原酸参与的反应， 故绿原酸参与的反应最好在pH＝7 或偏酸性的条件下， 防止绿原酸的效能降低或者提取率降低。

图9 pH 对绿原酸提取液稳定性影响

2.5.3 食品添加剂对于绿原酸稳定性的影响 由图10 可知，山梨糖醇，焦亚硫酸钠，葡萄糖等食品添加剂对于绿原酸提取液中绿原酸的含量有很大的抑制作用， 绿原酸已确定可以作为保健食品与饲料添加剂， 目前我国已经开始利用蒲公英中的绿原酸作为主要原材料制作一些饲料添加剂，故饲料添加剂中应注意绿原酸与其他一些食品添加剂的活性克制， 这三种食品添加剂经过试验研究都会对蒲公英中提取出来的绿原酸含量产生一定抑制作用。综上所述，在生产绿原酸有关饲料添加剂时要尽量避免与抑制绿原酸含量的其他添加剂一同制备。

图10 食品添加剂对绿原酸稳定性影响

3 结论

本文采用超声波辅助醇水溶液提取蒲公英中的绿原酸，在单因素试验基础上，以正交试验优化了提取工艺， 得到蒲公英中绿原酸的最佳提取工艺条件为料液比1:12（g/mL），提取温度60 ℃，提取时间1.5 h，提取溶剂体积分数50%，蒲公英中绿原酸平均得率3.18%。抗氧化性试验结果表明，蒲公英中绿原酸具有较好的抗氧化性作用。 稳定性试验结果表明， 蒲公英中绿原酸保存条件应在偏酸性且不宜与铜制品接触。 此研究为将蒲公英中绿原酸进一步开发为天然低毒的功能性饲料提供理论参考。