松子壳多酚超声波辅助提取工艺优化及其抗氧化性评价

木 慧， 杨申明， 王振吉， 朱晓娟， 陈华红， 李昱娴

（楚雄师范学院资源环境与化学学院，云南 楚雄 675000）

松子（pine nut）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物的种子，又名松实、果松子等。 松子在我国东北、西北和西南地区均有出产，是我国常见的一种坚果（仲美桥等，2022）。我国每年出口松子仁上万吨，出口量逐年在增加，但产品主要是以初加工的松仁为主。 目前松子的主要开发利用是松子仁、松子膜衣，而加工生产的大量副产品松塔、松子壳当作垃圾丢弃，造成资源浪费，影响了松子的综合利用价值。

松子壳中主要含有萜类、木质素、黄酮、维生素类、脂肪等化学成分，其中萜类、挥发油、脂肪酸等均具有重要生理活性（王智航等，2009）。 多酚（polyphenols） 是一类多羟基酚类化合物 （米智等，2022），具有较强的抗氧化、抗病毒和抗炎等活性（段宙位等，2021；Ward，2016；Martin，2015；Zhang，2014；Khan，2012），在治疗心脑血管、调节血压、 血脂等方面有重要生理作用（Asyakina，2021；Shan，2021； 蒋荣华等，2015；Saliu，2012）。Selani 等（2021）研究表明，葡萄皮多酚能够有效抑制鸡肉冷冻时期的脂质氧化作用， 孙承峰等（2005） 研究表明， 苹果多酚能够抑制猪肉氧化作用。 同时，多酚可作为食品功能有效成分与其他抗氧化剂起到协同作用 （孔方南，2020； 陈程等，2017）。 植物多酚因具有许多生物活性，且来源广泛、无副作用、摄入后易被肠道消化吸收等特点， 是一种应用前景十分广阔的饲料添加剂（张佳等，2022）。 因此，研究PNSP 提取，把PNSP用于饲料添加剂中， 对提高松子资源综合利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂 松子：产自云南楚雄，经楚雄师范学院鉴定为云南松子（落水松子）；没食子酸标准品（HPLC≥98.0%）、福林酚（分析纯）：北京萦莱宝科技有限公司；DPPH 自由基：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；维生素C：西陇科学股份有限公司；N-1-萘乙二胺盐酸盐： 天津市光复精细化工研究所；其他所用试剂均为AR：天津市大茂化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备 SK8210HP 超声波仪： 上海科导超声波仪器公司；UV-550 型分光光度计：上海元析仪器公司；SHZ ⅢA 循环真空泵： 巩义市予华仪器公司；CP224C 电子天平：奥豪斯仪器（上海）公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试材料处理 松子→去仁→得松子壳→烘干（60 ℃）→粉碎→过60 目筛→松子壳粉末→石油醚（沸程30 ～60 ℃）浸泡24 h 后，用索氏回流提取5 h（脱脂）→烘干（60 ℃）→得去除色素和油脂的松子壳干粉（备用）。

1.2.2 PNSP 制备 称取已去除色素和脱脂的松子壳干粉1.0 g，放入100 mL 三角锥形瓶中，加入体积分数46%乙醇32 mL，在50 ℃超声波中提取92 min 后，用真空泵抽滤，把得到的滤液定容在100 mL 容量瓶中，得PNSP 溶液。

在实践中，一些法定评估业务的委托人为了使评估对象评出预期的高价或者低价，达到非法目的，往往对评估专业人员施加非法干预，操控评估结果，使评估活动无法做到独立、客观、公正，无法起到防止国有资产流失、维护公共利益的作用。为此，本法第二十七条明确规定，委托人不得串通、唆使评估机构或者评估专业人员出具虚假评估报告。根据本条规定，委托人或者其他组织、个人非法干预评估行为和评估结果的，评估专业人员有权拒绝。同时，根据本法第十九条的规定，委托人要求出具虚假评估报告或者有其他非法干预评估结果情形的，评估机构有权解除合同。

1.2.3 PNSP 含量测定 采用福林酚法测定PNSP含量。 参考丁建英等（2018）的方法绘制没食子酸标准曲线，得回归方程A=0.12825C-0.01004（R2=0.999 03）。 PNSP 提取量计算公式为：

式中：C 为多酚质量浓度，mg/mL；V 为PNSP提取液定容的体积，mL；N 为稀释的倍数；M 为松子壳干粉质量，g。

1.2.4 PNSP 提取条件优化

1.2.4.1 单因素试验 本研究探究了液料比、乙醇体积分数、超声波提取时间、超声波提取温度4个因素对PNSP 提取量的影响， 考察了4 个影响因素的水平及其固定条件，试验条件如表1。

表1 超声辅助乙醇提取PNSP 工艺单因素试验

1.2.4.2 响应面试验 为了获得较佳的PNSP 提取条件，在单因素试验基础上，采用Design-Expert 8.0 软件， 以A 代表液料比，B 代表乙醇体积分数，C 代表超声时间，D 代表超声温度，Y 代表PNSP 提取量为响应值， 由Box-Behnken 中心组合进行试验，试验因素设计水平见表2。

表2 响应面试验因素和水平

1.2.5 PNSP 抗氧化能力测定 将本试验提取的PNSP 配 制成（0.0007、0.0022、0.0037、0.0052、0.0067 mg/mL）5 种质量浓度， 以维生素C 为对照，研究PNSP 抗氧化性。 PNSP 对DPPH·清除作用参考刘焕云等（2019）和胡栋宝等（2020）方法测定，PNSP 对·OH 清除作用参考金建等 （2020）方法测定，PNSP 对NO2-清除作用参考李志英等（2011）方法测定。

1.3 统计分析 每组试验做3 个平行样，采用origin 2019b 软件处理数据、作图，用Design-Expert 8.0 软件对试验提取工艺参数进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对PNSP 提取量的影响 由图1 可知， 随着液料比的不断增大，PNSP 的提取量呈现出先增大后减小趋势。 出现这种情况可能是溶剂增加， 松子壳粉与溶剂接触面增大，PNSP 提取量增加。 当溶剂用量增大到液料比30:1（mL/g）时，PNSP 提取量最大达到6.39 mg/g， 之后继续增大液料比，PNSP 提取量呈减小趋势。 这可能是当液料比增大到30:1（mL/g）时多酚物质已基本被提取出来， 再增大液料比会让PNSP 中其他杂质被溶解出来，且过大的液料比会造成溶剂浪费，增加生产成本。 因此， 选用液料比为20:1、30:1、40:1（mL/g）做响应面优化试验。

图1 液料比对PNSP 提取量的影响

2.1.2 乙醇体积分数对PNSP 提取量的影响 由图2 可知， 随着所用乙醇体积分数的增大，PNSP提取量也在不断增大。 当乙醇体积分数增大至45%时，PNSP 提取量达最大值为5.91 mg/g，之后随着所用乙醇体积分数继续增加，PNSP 提取量减小。 推测是体积分数为45%的乙醇与松子壳内多酚极性相近，有利于PNSP 被提取出来，当乙醇体积分数继续增加，溶剂极性增大，叶绿素等杂质更容易被释放， 导致多酚提取量减小 （周浓等，2020）。 因此， 选择乙醇体积分数为40%、45%、50%做响应面优化试验。

图2 乙醇体积分数对PNSP 提取量的影响

2.1.3 超声时间对PNSP 提取量的影响 由图3可知， 随着超声提取时间的增加，PNSP 提取量增大。 当超声时间继续增加到90 min 时PNSP 提取量达到最大值为5.91 mg/g， 之后随着超声时间的增加，PNSP 提取量又减小。这可能是由于超声提取达到90 min 时，PNSP 已大部分提出， 继续增加超声提取时间会加速多酚氧化分解。 因此，选择超声提取时间为80、90、100 min 做响应面优化试验。

图3 超声时间对PNSP 提取量的影响

2.1.4 超声温度对PNSP 提取量的影响 由图4可知，随着超声提取温度的逐步升高，PNSP 提取量也逐步增大。 这可能是由于适当的超声温度可以加快酚类物质的溶出，当超声温度为50 ℃时PNSP 提取量达到最大值为6.04 mg/g；之后再继续升高超声温度，这时PNSP 提取量逐步减小，这可能是由于超声温度太高导致多酚发生降解（胡会刚等，2020）。 因此，选择超声温度为45、50、55 ℃做响应面优化试验。

图4 超声温度对PNSP 提取量的影响

2.2 运用响应面试验优化工艺

2.2.1 试验设计与结果 采用Box-Behnken 设计原理，以PNSP 的提取量为响应值，在探究了单因素试验条件的基础上进行工艺优化， 试验设计结果见表3。

2.2.2 线性回归方程拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0 软件对表3 中的试验数据进行线性回归拟合， 得到PNSP 提取量与各因素变量间的回归方程为：Y=6.69+0.21A+0.22B+0.09C+0.072D -0.16AB +0.13AC +0.0075AD +0.058BC -0.042BD-0.09CD-0.40A2-0.37B2-0.35C2-0.25D2。

方差分析结果见表4，从表4 分析可知，回归方程的模型P＜0.0001，表明模型达到了极显著；失拟项P =0.9299＞0.05，表示差异不显著，说明该模型与实际情况拟合度较好。 由R2=0.9690，R2Adj=0.9590， 说明该方程模型能够较好反映真实的试验数据结果。

表4 试验方差分析

方程模型中一次项A、B 两项对PNSP 提取量的影响达到极度的显著（P＜0.0001），C 项达到了高度的显著（P＜0.01），D 项达到了显著水平（P＜0.05）， 说明所考察的液料比和乙醇体积分数对PNSP 提取量影响程度较大， 超声波提取时间次之，超声波提取温度影响最小。因此在PNSP 提取中要严格控制液料比和乙醇体积分数； 两两交互项中AB 项高度显著（P＜0.01），AC 项显著（P＜0.05），说明本试验的液料比和乙醇体积分数两两因素交互作用对PNSP 提取量的影响较大， 液料比和超声时间次之； 各因素的二次项均对PNSP提取量有显著影响。

2.2.3 响应面图分析 各因素交互作用对PNSP提取量影响的响应面和等高线图如图5 所示。 由响应面图分析可知，液料比、乙醇体积分数对PNSP 提取量影响显著。 根据等高线图的分析可知，液料比与乙醇体积分数、 超声提取时间之间的交互作用对PNSP 提取量影响显著， 其他因素之间交互作用不够明显，与试验方差分析结果一致。

图5 两因素之间的交互作用对PNSP 提取量影响的响应面和等高线图

利用Design-Expert 8.0 软件对PNSP 提取工艺参数优化，得到最优提取条件为液料比（乙醇体积与松子壳粉末质量之比）32.37:1（mL/g）、乙醇体积分数46.27%、 超声时间91.80 min、 超声温度50.47 ℃，在该条件下，得到PNSP 提取量的模型预测值为6.75 mg/g。 考虑到实际操作条件情况，将工艺条件的理论值修正为液料比32:1（mL/g）、乙醇体积分数46%、超声时间92 min、超声温度50 ℃，在上述试验条件下得到PNSP 提取量为 （6.72±0.32）mg/g，与模型预测值（6.75 mg/g）接近，说明本试验优化的工艺条件可靠，可用于实际生产。

2.3 PNSP 抗氧化性测定结果

2.3.1 PNSP 对DPPH·清除效果 由图6 可知，清除DPPH·的能力随着PNSP 质量浓度的增大而增强， 当PNSP 质量浓度为0.0067 mg/mL 时，对DPPH·清除率为50.46%， 与维生素C 的清除率（56.25%）接近，这表明PNSP 对DPPH·有一定的清除效果。

图6 PNSP 对DPPH 自由基的清除效果

2.3.2 PNSP 对·OH 清除效果 由图7 可知，清除·OH 的能力随着PNSP 质量浓度的增大而增强，当PNSP 质量浓度为0.0067 mg/mL 时，对·OH清除率为43.10%，与维生素C 清除率（50.47%）相比稍弱，但PNSP 仍然有一定的清除·OH 能力。

图7 PNSP 对羟基自由基的清除效果

2.3.3 PNSP 对NO2- 的清除效果 由图8 可知，在所试验的PNSP 质量浓度范围内，随着PNSP 质量浓度的增大清除NO2- 的能力逐渐增强，当PNSP 质量浓度为0.0067 mg/mL 时， 对NO2- 清除率为48.92%，与维生素C 清除率（55.04%）相比稍弱，但PNSP 也表现出一定的清除NO2-能力。

图8 PNSP 对亚硝酸根离子的清除效果

3 结论

运用响应面试验优化超声辅助提取PNSP，最佳提取工艺条件为液料比32:1（mL/g），乙醇体积分数46%，超声时间92 min，超声温度50 ℃，在该条件下，得到PNSP 提取量为（6.72±0.32）mg/g，与预测值（6.75 mg/g）接近，说明该工艺条件可靠，可用于PNSP 提取。

抗氧化性试验表明，PNSP 质量浓度在0.0007 ～0.0067mg/mL 内，随着PNSP 质量浓度的增大，清除DPPH·、·OH 和NO2-的能力增强， 当PNSP 质量浓度为0.0067 mg/mL 时，DPPH·、·OH 和NO2-的清除率分别为50.46%、43.10%和48.92%，这说明PNSP 具有一定的抗氧化能力。 本研究结果可为PNSP 的提取及在饲料工业和动物生产上的应用提供参考。