豆粕饲料中添加丁酸钠对大口黑鲈肠道菌群组成的影响

时间：2024-05-23

常阔，高世阳，田二杰，孙晓辉，赵晓雨，孙平，陈卫军

（1.河南科技大学，河南洛阳 471000；2.洛阳市农业技术推广服务中心，河南洛阳 471023）

鱼粉因富含蛋白质、氨基酸组成平衡、适口性好等原因，一直以来是肉食性鱼类饲料中不可或缺的一种饲料原料（Hodar 等，2020）。然而，随着水产养殖业的迅猛发展以及鱼粉的资源量有限（Jannathulla 等，2019），导致鱼粉供不应求，价格飙升，养殖的成本也随之提高。为了解决鱼粉短缺和其价格高昂的问题，许多植物性原料被用于替代鱼粉。豆粕是大豆提取油脂后的副产物，因蛋白质含量高、来源广泛、价格低廉，被认为是最有希望替代鱼粉的植物性蛋白源（Robinson 等，1994）。豆粕替代鱼粉降低了养殖成本，在一定程度上缓解了鱼粉短缺的压力，然而，其在水产饲料中的添加也造成了一些问题，如改变鱼类肠道内微生物的菌群组成与结构，造成肠道菌群失调（Zhou 等，2018；Miao 等，2018）。肠道菌群通过自身或其代谢产物参与鱼类的营养代谢、免疫调节等过程，其稳态对鱼体生长和健康具有重要作用（Yukgehnaish 等，2020）。因此，在豆粕替代鱼粉的过程中，寻求改善鱼类肠道菌群稳态的营养策略已迫在眉睫。

丁酸钠是丁酸的钠盐，被广泛用于畜禽和水产饲料，具有促进鱼体生长、抗菌、抗炎等功效（Abdel-Latif 等，2020）。研究表明，丁酸钠可用于改善水产动物的肠道菌群组成，如罗非鱼（Alves Jesus 等，2021）、大菱鲆（Liu 等，2019）和红拟石首鱼（Yamamoto 等，2021）等。大口黑鲈（Micropterus salmoides）是一种具有较高的经济价值和深受消费者喜爱的淡水肉食性鱼，其对鱼粉有着很强的依赖性，饲料中鱼粉的用量一般在40% ～ 55%（Yang 等，2022）。已有研究结果表明，豆粕替代30%鱼粉会造成大口黑鲈肠道菌群紊乱（He 等，2020）。为此，本研究以大口黑鲈为研究对象，拟在豆粕饲料中添加丁酸钠，研究丁酸钠对其肠道菌群组成的影响，以期为丁酸钠在水产饲料中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料本试验设置3 个处理组：对照组、豆粕组、丁酸钠组。豆粕组替代对照组饲料中30%的鱼粉；丁酸钠组是在豆粕饲料的基础上添加0.2%的丁酸钠。饲料组成与营养水平见表1。各组原料均粉碎并通过60 目筛，逐级混合后，由环模颗粒机制成直径为2.0 mm 的硬颗粒沉性饲料，室温风干并储存在-20 ℃冰箱备用。

1.2 饲养管理试验用大口黑鲈鱼苗购于广东省某鱼厂，为同一批繁殖的健康苗种。试验于河南科技大学动物科技学院开展。对鱼体进行消毒后，于养殖间暂养7 d，待其适应环境后选取体质量（6.30±0.01）g、健康状况良好的大口黑鲈180 尾，随机分为3 组，每组3 个重复，每个重复20 尾。正式试验在透明玻璃缸（60 cm×40 cm×50 cm）中进行，每日9：00 和17：00 投喂2 次，每次投喂至表观饱食，养殖周期持续56 d。养殖期间水温（25.5±0.6）℃，pH 为7.0 ～ 7.8，溶氧量大于6 mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度低于0.1 mg/L。

1.3 样品采集与分析测定

1.3.1 样品采集投喂最后一餐后6 h，每缸随机取3 尾鱼，使用三氯叔丁醇（5 g/L）安乐死。随后用消毒后的解剖剪剖腹，取出整个肠道。使用酒精棉擦拭肠管外壁后，将全肠的内容物收集在无菌冻存管中，液氮速冻，置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 基因组DNA 提取和PCR 扩增采用十六烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠法提取样品总基因组DNA。提取的DNA 用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 浓度和纯度。根据DNA 浓度用无菌水稀释成1 ng/μL，用于聚合酶链式反应（PCR）。

以16S rRNA 的V3 和V4 区域为目标合成带有barcode 的特异引物。引物序列为338F（5′-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。 PCR 反应在ABI GeneAmp9700 型上进行，反应总体积为30 μL，包含15 μL PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix、0.2 μmol 正反向引物和10 ng 模板DNA。 PCR 扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。将同一样本的PCR 产物混合后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用Gene JET Gel Extraction Kit （Thermo Scientific）纯化，QuantiFlourTM-ST （Promega 公司）定量。使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 试剂盒生成测序文库，并在Illumina MiSeq平台上测序。

使用QIIME 软件对序列数据进行生物信息学分析。使用97%相似度的分类单元（OUT），利用mothur 软件做样品稀释性曲线。采用基于β 多样性距离的聚类分析和非度量多维尺度分析（NMDS）描述不同样本间的相似性和差异关系。采用STAMP 软件比较不同处理肠道微生物在门和属水平上的相对丰度。利用PICRUSt 菌群代谢功能预测工具比对基因功能谱数据库，推测微生物群落的功能类别丰度信息。

1.4 数据处理所有数据均以“平均值±标准误”表示。使用SPSS v.20.0 软件进行单因素方差分析；利用Turkey-Kramer 事后检验进行组间差异比较。P＜0.05 表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 样品测序质量分析每个处理随机抽取三个样本，使用稀释性曲线检测样本测序数据量的合理性（图1）。当测序数量大于4000 条时，不同处理组大口黑鲈肠道菌群稀释性曲线趋于平缓。测序覆盖率≥97%，表明对各组的大口黑鲈肠道微生物菌群的测序深度合理，能覆盖样品中的绝大部分物种。

图1 样品稀释曲线

2.2 菌群结构相似性分析如图2 所示，从大口黑鲈肠道内容物中共鉴定获得细菌21 个纲，88个目， 374 个属，691 个OTU。对照组特有纲、目、属和OUT 的数量分别为1、9、62 和162；豆粕组特有纲、目、属和OTU 的数量分别为1、6、39 和92；丁酸钠组特有纲、目、属和OTU 的数量分别为2、6、58 和151。对照组和豆粕组共享12 个纲、48个目、134 个属和181 个OTU。对照组和丁酸钠组共享15 个纲、55 个目、154 个属和202 个OTU。

图2 大口黑鲈肠道菌群Venn 图

为了进一步比较不同处理组肠道菌群结构的差异，采用基于菌群β 多样性的聚类分析和NMDS 分析各处理组肠道菌群样品。聚类分析中，对照组和豆粕组样品间的距离较远，而对照组和丁酸钠组样品间的距离较短（图3A）。与聚类树结果类似，NMDS 分析中，对照组和丁酸钠组样品分布于坐标轴的左侧，而豆粕组样品分布于坐标轴的右上侧（图3B）。

图3 大口黑鲈肠道菌群相似性分析

2.3 菌群组成及其相对丰度分析各处理组肠道所含的菌门主要为蓝藻门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、软壁菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（图4A）。相比于对照组，豆粕组厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）和糖化细菌门（Saccharibacteria）的相对丰度分别降低了89.4%、81.7%、87.7%和100.0%（P＜0.05），软壁菌门的相对丰度升高了4797.0%（P＜0.05）。相比于豆粕组，丁酸钠组软壁菌门和厚壁菌门的相对丰度分别降低和升高了98.3%和442.8%（P＜0.05）（图4B）。

图4 大口黑鲈肠道菌群在门水平上的相对丰度

大口黑鲈所含的菌属主要为支原体属（Mycoplasma）、虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、Alpinimonas 属、红球菌属（Rhodococcus）、束村氏菌属（Tsukamurella）、戈登氏菌属（Gordonia）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和拟杆菌属（Bacteroides）（图5A）。相比于对照组，豆粕组虚构芽孢杆菌属、乳杆菌属、魏斯氏菌属和片球菌属（Pediococcus）相对丰度分别降低了90.0%、95.6%、71.2%和73.9%（P＜0.05），支原体属相对丰度增加了5073.0%（P＜0.05）。相比于豆粕组，丁酸钠组支原体属相对丰度降低了98.3%（P＜0.05），拟杆菌属和葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度分别升高了911.1%和569.0%（P＜0.05）。

图5 大口黑鲈肠道菌群在属水平上的相对丰度

2.4 肠道菌群功能预测利用PICRUSt 将不同处理组大口黑鲈肠道菌群的16S RNA 基因比对到EggNOG （Evolutionary Genealogy of Genes：Non-supervised Orthologous Group）数据库，进行菌群功能预测。 COG 功能分类统计结果表明，相比对照组，豆粕组大口黑鲈肠道菌群在“氨基酸转运代谢”“细胞运动”“RNA 加工修饰”“脂质转运代谢”“细胞骨架”“翻译后修饰，蛋白质折叠和伴侣蛋白”“能量生成和转换”“翻译、核糖体结构和生物合成” 等功能类群的相对丰富显著升高，在“抵御机制”“碳水化合物转运代谢”“信号转导机制”“复制、重组和修复”功能类群的相对丰富显著降低（P＜0.05）。相比于豆粕组，丁酸钠组大口黑鲈肠道菌群在 “复制、重组和修复”功能类群的相对丰度显著升高，在“次级代谢物生物合成、转运和代谢”功能类群的相对丰度显著降低（图6）（P＜0.05）。

图6 大口黑鲈肠道微生物COG 功能分析

3 讨论

鱼体肠道微生物菌群及其代谢产物与肠道功能密切相关，在宿主代谢、营养、生理和免疫过程中发挥着重要作用（Gerritsen 等，2011）。本研究中，豆粕替代鱼粉严重改变了肠道菌群组成，这与大口黑鲈（He 等，2020）和乌鳢（Miao 等，2018）的研究结果一致。然而，豆粕替代鱼粉饲料中添加0.2%丁酸钠，在一定程度上恢复了肠道菌群的组成。菌群Venn 图、聚类树和NMDS 分析结果均表明，丁酸钠组和对照组鱼体肠道菌群的组成更加接近，这表明丁酸钠有助于肠道菌群的恢复。

厚壁菌门是鱼类肠道菌群的主要门类，可增强肠道屏障功能，减轻炎症反应，包括乳杆菌、虚构芽孢杆菌、粪杆菌、魏斯氏菌片球菌和葡萄球菌等菌属（Yukgehnaish 等，2020；Kaur 等，2019）。乳杆菌、虚构芽孢杆菌、魏斯氏菌、片球菌和葡萄球菌是重要的乳酸菌（Ringo/等， 1998；Vandenbergh等，1993）；粪杆菌能够产生丁酸（Macfarlane 等，2012）。拟杆菌也可产生乳酸。乳酸菌和丁酸与鱼体肠道健康密切相关，可增强鱼体生长和免疫（Abdel-Latif 等，2020；Ringo 等，2010）。本研究中，豆粕替代鱼粉显著降低了厚壁菌门、乳杆菌属、魏斯氏菌属和片球菌属的相对丰度。然而豆粕饲料中添加0.2%的丁酸钠显著增加了厚壁菌门、拟杆菌属和萄球菌属的相对丰度，表明丁酸钠可增加肠道有益菌含量，改善肠道健康。

支原体属于软壁菌门，是已知最小的能够自我复制的自由生活微生物之一（Sellyei 等，2021），也是导致肠道相关疾病（如肠炎）的潜在致病细菌（Gnanadurai 等，2020；Razin 等，1998）。豆粕替代鱼粉显著提高了大口黑鲈肠道菌群中支原体的相对丰度，这与大口黑鲈之前的研究结果一致（Yang 等，2022；He 等，2020）。支原体相对丰度升高在鱼类中已被证明与炎症存在极显著正相关（Chen 等，2023），可能是造成豆粕诱导性肠炎的主要因素。本研究中，相比对照组，豆粕饲料大口黑鲈在“抵御机制”功能类群的相对丰度显著降低，这可能与豆粕饲料易引起肠炎和降低鱼体疾病抵抗力等现象有关（Urán 等，2008；Krogdahl等，2000）。本研究中，豆粕饲料添加丁酸钠显著降低了支原体相对丰度，表明丁酸钠可能具有缓解豆粕诱导性肠炎的作用。丁酸钠降低支原体相对丰度的现象也出现在其他水产动物中，如鲫鱼（Li 等，2022）和摄食高脂饲料的大口黑鲈（Chen等，2023）。