不同苜蓿越冬期根系生理代谢响应研究

王晓龙， 杨 曌 ， 来永才， 钟 鹏， 柴 华， 李莎莎，徐艳霞， 吴 玥， 王建丽， 高海娟， 李 莉， 张 杨， 李 伟

（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005；2.黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，黑龙江 哈尔滨 150086；3.黑龙江省农业科学院草业研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）具有产量高、品质优、适应性强、适口性好等优良特性（赵一航等，2021；朱爱民等，2019）。但在我国北方地区种植，部分苜蓿品种存在越冬率偏低的问题，并且苜蓿品种不同表现出来的越冬率亦不同。黑龙江地区是我国重要的畜牧业发展基地， 特别是奶牛、肉牛等养殖业的发展带动了苜蓿产业的全面发展。然而影响黑龙江地区苜蓿生长最为关键的因素之一是越冬。正因如此选择适宜黑龙江地区种植的苜蓿品种，不仅要求高产、优质，而且还应具有较强的抗寒性（崔国文，2009）。 寒冷地区苜蓿引种或管理不当会导致苜蓿越冬率偏低，甚至苜蓿植株大量死亡，给种植户和企业造成巨大的经济损失。目前解决苜蓿越冬问题的关键是了解苜蓿对寒冷适应的规律和特点，以及苜蓿根系对抗寒性的响应（王晓龙等，2022；马周文等，2016；Brumme 等，2002）。当植物面临低温时，体内会产生一系列生理生化反应，通过提高一些调节物质如游离脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、超氧化物歧化酶（SOD）等含量和酶活性来保护植物免受低温伤害，这些调节物质常被作为评价植物抗寒性的重要指标（马周文等，2016）。 通常苜蓿在秋末冬初停止生长， 地上部的营养物质会转移至根部，以备翌年再生。 所以苜蓿根系既是植物生长时水分和营养物质的吸收器官，亦是苜蓿越冬时重要的贮藏器官，其存储营养物质的多少直接影响着植株的越冬与再生性。由于耐寒性是一个复杂的数量性状，仅靠单一指标还无法判定苜蓿的抗低温能力强弱，因此，如何选择适宜的生理指标来评价苜蓿品种抗寒性，已成为当前寒区苜蓿产业化发展亟须解决的一大难题（李波等，2021；Cunningham 等，2001）。所以本研究以国内外不同苜蓿品种为试验材料， 通过对苜蓿越冬期根系内的渗透调节物质、 细胞膜脂质过氧化和保护酶活性等物质进行测定， 旨在探究苜蓿越冬期根系生理代谢响应机制， 并评价出不同品种之间的抗寒性强弱等级， 为寒区苜蓿引种栽培及抗寒种质资源鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况 试验地位于齐齐哈尔市富拉尔基，E 123°24′36″，N 47°9′，最低温度-39.5 ℃，年均气温3 ℃，积温（≥10 ℃）2722.1 ℃，年均降水量约480 mm，无霜期132 d 左右。 试验地土壤为黑风沙土，有机质19.89 g/kg，全氮1.19 g/kg，速效磷10.60 mg/kg，速效钾124.84 mg/kg。

1.2 试验材料 选取国内外苜蓿材料5 份，其中草原3 号由内蒙古农业大学提供； 公农2 号由中国农业科学院草原所提供； 龙牧801 由黑龙江省农业科学院提供；皇后、赛迪苜蓿由百绿（天津）国际草业有限公司提供。

1.3 试验设计 试验小区面积20 m2（4 m×5 m），2021 年6 月进行人工条播，采用随机区组设计，行距40 cm，3 次重复，以龙牧801 为保护行。 播前试验小区均未施底肥，播种后及时镇压。 试验期间进行灌溉、 除草、 病虫防治等田间管理措施。 越冬期每隔60d（冷胁迫：10 月30 日；冻胁迫：12 月30 日）田间挖取苜蓿根系，以8 月30日为对照（CK），测定供试品种越冬期根系各项生理指标。

1.4 测定方法 生理指标测定参照史树德等（2011）主编的《植物生理学实验指导》方法进行。游离脯氨酸（Pro）测定采用茚三酮法；可溶性糖（SS）测定采用蒽酮法；可溶性蛋白（SP）测定采用考马斯亮蓝法；丙二醛（MDA）测定采用硫代巴比妥酸法；SOD 测定采用氮蓝四唑法； 相对电导率（EC）测定采用电导法。

1.5 统计分析 采用Excel 2010 软件进行数据处理， 用Sigma Plot 12.5 软件作图，SAS 9.0 软件进行方差分析和相关性分析。 应用模糊数学隶属函数法（王晓龙等，2022；赵一航等，2021），综合评价所测指标，求各项生理指标隶属函数值，若测定指标与苜蓿低温抗寒性呈正相关：

测定指标与苜蓿低温抗寒性呈负相关：

式中：Fij为i 草种j 指标值；Xij为鉴定i 草种j 指标隶属值；Ximax为所鉴定i 草种j 指标最大值；Ximin为所鉴定i 草种j 指标最小值。 将i 草种各项指标函数值进行累加，求平均值，均值越大则苜蓿品种耐寒性越强。 最后将5 个苜蓿品种的耐寒性进行比较，得出品种间抗寒强弱顺序。

2 结果与分析

2.1 可溶性糖和游离脯氨酸 由图1 可知，供试品种根系中可溶性糖和游离脯氨酸含量均呈先升后降的变化，可溶性糖含量由38.13 ～39.62 mg/g升至51.86 ～60.27 mg/g 又降至43.19 ～52.95 mg/g； 游离脯氨酸含量由364.88 ～374.44 nmol/g升至630.86 ～689.53 nmol/g 又降至463.60 ～628.21 nmol/g；冷胁迫下，各品种可溶性糖积累量呈现最高值，以品种龙牧801、草原3 号和公农2 号的可溶性糖含量较高， 其次是皇后苜蓿（57.21 mg/g）， 而赛迪苜蓿可溶性糖含量显著低于其他品种（P＜0.05）。 随胁迫程度加剧，各品种可溶性糖含量有所下降， 其中龙牧801 和公农2号的可溶性糖含量显著高于其他品种（P＜0.05），而皇后和赛迪苜蓿较低。

图1 苜蓿根系可溶性糖和游离脯氨酸含量变化

冷胁迫下， 各品种游离脯氨酸含量亦呈现最高值，与对照组相比增高72.36% ～84.15%，且各品种间差异较大， 其中龙牧801 和公农2 号游离脯氨酸含量显著高于其他品种（P＜0.05），草原3号次之， 而皇后和赛迪苜蓿游离脯氨酸积累量较低；冻胁迫下，龙牧801 的游离脯氨酸含量最高，相比游离脯氨酸最低赛迪高35.51%，且显著高于其他品种（P＜0.05）。上述结果表明，越冬初期，耐寒品种通过积累较多的可溶性糖和游离脯氨酸含量来抵御严冬， 反之抗寒性弱的品种可溶性糖和游离脯氨酸含量较低。

2.2 可溶性蛋白和SOD 由图2 可知， 所有品种根系可溶性蛋白含量由37.96 ～38.58 μg/g 升至45.05 ～53.10 μg/g 又降至40.21 ～41.96 μg/g。冷胁迫下，各品种可溶性蛋白含量迅速增加，与对照相比增加18.67% ～37.64%， 且不同品种间差异也显著增大， 其中龙牧801 的可溶性蛋白含量显著高于其他品种（P＜0.05）；冻胁迫下，龙牧801和公农2 号可溶性蛋白含量较高， 显著高于皇后和赛迪（P＜0.05）。 上述结果表明，品种龙牧801和公农2 号可溶性蛋白的增加可有效增强细胞的渗透调节能力，从而提高苜蓿耐寒性，反之皇后和赛迪苜蓿可溶性蛋白积累量较少，抗寒性较弱。

图2 苜蓿根系可溶性蛋白和SOD 活力变化

各品种根系的SOD 活性由39.53 ～40.96 U/g FW 升至47.66 ～55.15 U/g FW 又降至42.93 ～47.83 U/g FW。 冷胁迫时，各品种根系的SOD 活性呈现最高值，其中龙牧801 和公农2 号的SOD活性显著高于其他品种（P＜0.05），而皇后和赛迪苜蓿的SOD 活性较低； 随胁迫加剧，SOD 活力有所下降；冻胁迫下，龙牧801、公农2 号和草原3号的SOD 活性较高，与其他品种相比差异显著（P＜0.05）。 该结果表明，抗寒品种更易增强SOD 酶活性，SOD 可通过歧化反应清除超氧阴离子自由基，进而提高苜蓿对低温的适应能力。

2.3 丙二醛和相对电导率 由图3 可知，各品种的丙二醛含量由起初的52.45 ～53.02 nmol/g 升高至64.53 ～97.42 nmol/g。 与对照相比，龙牧801和草原3 号冷胁迫下丙二醛上升较为缓慢， 而皇后和赛迪苜蓿的丙二醛迅速升高， 分别比对照增加37.90%和47.88%。 随胁迫强度加剧，各品种在冻胁迫下丙二醛呈现最高值， 以品种皇后和赛迪苜蓿的丙二醛含量较高， 而龙牧801 和草原3 号的丙二醛含量显著低于其他品种（P＜0.05）。

图3 苜蓿根系丙二醛和相对电导率变化

越冬期各品种相对电导率随冷冻胁迫增加呈现升高的变化， 相对电导率由8.16%～8.38%升至54.08%～70.70%。 与对照相比，各品种冷胁迫时的相对电导率增加252.12% ～366.70%； 冻胁迫时，各品种的相对电导率呈现最高值，以赛迪苜蓿的相对电导率最高， 显著高于其他品种 （P＜0.05），而龙牧801、草原3 号和公农2 号的相对电导率较低。

2.4 综合评价 相关性结果表明，苜蓿耐寒指标游离脯氨酸与SOD、可溶性糖、蛋白之间呈极显著或显著正相关，相关系数分别为0.916、0.869 和0.566，即脯氨酸含量越高，可溶性糖、蛋白、SOD的含量和活性增加， 细胞渗透调节和抗氧化能力增强，则苜蓿的耐寒性越强。丙二醛与相对电导率呈极显著正相关（P＜0.01；0.851），说明低温下品种的丙二醛含量越高， 则品种的细胞膜伤害程度较重，膜透性增大，相对电导率升高（表1）。 运用隶属函数对品种的抗寒性进行综合评价，最终得出抗寒强弱顺序依次为： 龙牧801 （0.529）＞公农2 号（0.523）＞草原3 号 （0.514）＞皇后 （0.468）＞赛迪（0.463）（表2）。

表1 相关性分析

表2 隶属函数分析

3 讨论

渗透调节是植物通过积累脯氨酸、糖类、蛋白等物质使低温下的植物细胞维持一定的膨压，以减少细胞内水分的流失， 避免因结冰对植物细胞造成损害（邱乾栋等，2009）。 低温下，植物细胞渗透调节过程的关键是细胞内溶物的主动积累（Haagenson 等，2003）。 由于渗透调节的暂时性和有限性，渗透调节并不能维持整个生理过程（郭子武等，2004）， 因此通过渗透调节抵御寒冷有一定的局限性。苜蓿遇冷胁迫时，组织可溶性糖含量表现为增加趋势，抗寒品种龙牧801、草原3 号和公农2 号的可溶性糖含量显著高于其他品种， 随胁迫加剧，可溶性糖含量有所下降，这与陶雅和孙启忠（2008）的研究结果相一致，说明抗寒品种之所以在寒冷环境中表现出强抗寒性， 与其自身积累较多的可溶性糖密切相关（孙予璐等，2017）。游离脯氨酸作为一种细胞渗透调节物质， 其积累与低温相关，低温胁迫下苜蓿游离脯氨酸普遍增加，本研究中， 冷胁迫下龙牧801 和公农2 号游离脯氨酸含量较高；随胁迫加剧，游离脯氨酸含量有所降低，而龙牧801 的脯氨酸含量仍最高，说明品种在寒冷环境中细胞失水后， 可通过提高根系内游离脯氨酸的含量， 增加细胞液浓度以对根系细胞起保护作用， 即游离脯氨酸可作为细胞冰冻保护剂保护原生质体（王小华和庄南生，2008），低温下，苜蓿可溶性蛋白变化趋势类似于游离脯氨酸，也与抗性相关。 抗寒能力越强， 品种可溶性蛋白含量越高， 如龙牧801 在冷胁迫下可溶性蛋白积累量达到峰值，并且显著高于其他品种，说明抗寒品种通过积累可溶性蛋白来增强根系保水能力，减轻低温伤害（张丽娟，2008）。

低温时， 膜系统尤其是作为连接细胞与环境界面的质膜为最初受害部位。 低温冻害首先作用于质膜，通常表现为膜透性变大，电解质及小分子有机物渗漏（陈卫东等，2021）。丙二醛为膜系统的过氧化产物，其含量高低可反映植物受害程度。保护酶SOD 具有清除自由基的作用，其活力变化可作为植物的耐寒指标 （江福英等，2002；Mckersie等，2000）。本研究中，各品种丙二醛含量随低温胁迫加剧呈上升趋势，相同低温（冻胁迫）下与耐寒性弱的品种相比， 抗寒品种 （龙牧801 和草原3号）根系中丙二醛积累量和增幅较小，细胞膜损伤程度较轻，抗氧化能力较强。杨秀娟（2006）在研究苜蓿根茎与抗寒性的关系时指出，根茎中SOD 酶活性随温度降低呈先升后降变化趋势。本研究中，越冬初期各品种SOD 活性增加迅速， 且品种间SOD 酶活性差异较大，如龙牧801 和公农2 号的SOD 活性最高； 随胁迫加剧，SOD 酶活性有所降低但仍维持较高水平， 说明抗氧化酶活性与品种遗传特性有关， 保护酶活力持久性能体现品种抗寒性（Brouwer 等，2000）。 越冬期不同苜蓿相对电导率随温度降低呈现增加趋势，冻胁迫下，以赛迪和皇后相对电导率较高。 苜蓿抗寒性与低温下细胞膜透性存在一定关联， 抗寒品种可通过降低细胞膜透性以减轻伤害，进而增强根系耐寒能力，反之则非抗寒品种细胞膜透性增大， 相对电导率升高（王运涛等，2012）。 抗寒性越高的品种，其根系内游离脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量与SOD 活性在冷冻胁迫下显著高于其他品种。据此，越冬期根系内含物含量与活性的变化是鉴别品种抗寒性强弱的有效手段，经隶属函数评定得出龙牧801、公农2 号和草原3 号为强抗寒品种。

4 结论

本试验结果表明，随地温降低，根系内游离脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量和SOD 活性呈先升后降的变化，丙二醛和相对电导率则呈上升趋势。抗寒性强的品种根系内含物的含量和活性在低温下显著高于其他品种。简言之，越冬期根系内含物含量与活性的变化是鉴定品种抗寒性强弱的有效手段， 依此排列的品种抗寒强弱顺序依次为： 龙牧801＞公农2 号＞草原3 号＞皇后＞赛迪。