微生物对黄曲霉毒素去除的研究进展

常程程， 丁梓雪， 王彦钦， 杨 帆， 孟宪刚

（兰州交通大学生物与制药工程学院，甘肃 兰州 730000）

黄曲霉毒素是由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌产生的次级代谢产物， 主要是由一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮组成，是二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素有20 多种，常见的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。 其中AFB1的毒性最强，危害最大，因此被用来作为AF 的评价指标（谢慧等，2020）。 玉米、小麦、花生、玉米秸秆等农产品因贮存不当或其他原因都会污染黄曲霉毒素。全世界范围内，每年有1600 万t 粮食受到黄曲霉毒素污染，给农业生产造成巨大的经济损失。

黄曲霉毒素具有极强的毒性和致癌性， 威胁农业发展、粮食安全和人类健康。土壤中存在黄曲霉毒素的污染，可引起土壤理化性质改变，土质退化，使农作物枯萎减产（王晓艳等，2021）。 中国食品中黄曲霉毒素允许量标准（μg/kg）为：花生油、坚果和干果中AFB1≤20 μg/kg；玉米、花生仁制品中AFB1≤20 μg/kg；大米及其他食用油中AFB1≤10 μg/kg；面粉、发酵食品、淀粉类制品中AFB1≤5 μg/kg。 摄入后，AFB1和AFB2被肝脏代谢成它们的羟基化代谢物M1（AFM1）和M2（AFM2），它们可以在尿液、粪便中排泄（Tozzi 等，2016），可导致人和牲畜营养代谢不良、不孕、先天畸形、内分泌紊乱 （邢福国等，2021；Valencia-Quintana 等，2020），严重时可诱发肝脏疾病，导致肝癌，对人体的免疫系统具有极大的危害性。 连续摄入少量黄曲霉毒素会慢性中毒， 一次摄入大量的黄曲霉毒素会中毒死亡（罗昱芬，2017；关心，2016）。

1 黄曲霉毒素的常见去除方法

实现粮食中黄曲霉毒素的去除， 可以通过主动预防和被动去除两种方式，目前常用的降解AF的方法主要有物理方法、化学方法和生物方法。

1.1 物理法 物理法通过高温加热、吸附、紫外线照射、 超声和低温等离子体技术等方式（Wu等，2021），破坏细胞膜及DNA，防止细胞复制，杀死黄曲霉， 或使毒素结构破坏使呋喃环的化学键断开，或通过吸附剂将AFB1吸附，从而达到去除AFB1的效果 （贺冰，2016）。 张小勇等 （2015）用254、365 nm 和420 nm 三种不同波长的紫外灯照射大豆油脂，并对黄曲霉毒素B1去除情况进行了比较，发现365 nm 波长紫外灯的去除效果最佳，为96.4%，达到食用油卫生标准要求，但油脂、酸值及过氧化值升高，对油脂的质量有一定影响。其优点是时间短、见效快，如紫外线辐射具有很强的杀菌能力， 但紫外线辐射需要在特定波长下才能起作用，深度有限，存在降解不彻底的问题，且对粮食的质量和营养价值有一定影响。

1.2 化学法 化学法是在加工过程中使用化学物质与黄曲霉毒素发生反应， 将黄曲霉毒素转化为无毒或低毒的产物， 达到去除黄曲霉毒素的效果，常用的方法有强酸强碱处理法、臭氧熏蒸法、电解水技术等（卢丹等，2018）。强碱处理可以破坏黄曲霉毒素的内酯环， 生成香豆素和无毒的钠盐（刘畅等，2010）。 杨威（2019）用一定pH 的NaOH液处理脱皮破碎的花生， 一段时间后花生油中AFB1含量逐渐降低，AFB1脱除率达98.0%， 但在处理过程中，酸价和碘值在国标规定范围内，过氧化值超出了国标限定值。 化学物质对毒素降解彻底，有极强的灭活能力，但化学法成本高，操作复杂，具有一定危险性，且容易发生二次污染，会有残留，用于粮食作物营养成分流失很大，在大多数情况下应用起来较为困难。

1.3 生物法 生物手段防控真菌污染是一种绿色、安全、高效的方法，包括微生物或植物提取物对黄曲霉毒素进行吸附去除或分解代谢， 或是利用微生物的代谢产物拮抗真菌， 并控制环境条件（光照、水分和温度等），抑制黄曲霉的孢子萌发和生长。 生物方法脱毒反应条件温和、专一性强、成本低，具有较高的防控效果和应用前景。

2 黄曲霉毒素的微生物去除方法

微生物去毒方法主要包括菌体吸附和生物降解两种方式，近年来，已被证实许多细菌和真菌都有去除黄曲霉毒素的能力，如芽孢杆菌、肠杆菌、乳酸菌、沙雷氏菌、假单胞菌、红球菌、米曲霉和黑曲霉等 （赵雪芹等，2020； 张盼等，2015；Deepak等，2015；杨文华，2013；翟翠萍等，2012）。 微生物通过酶促反应破坏AFB1的毒性结构位点双呋喃环末端双键、内酯环和环戊烯酮环，产生无毒无害的降解产物。

2.1 微生物对黄曲霉毒素的吸附作用 在微生物吸附方面，研究最多的是酵母菌和乳酸菌，吸附方式主要为物理结合， 它们可以通过菌壁上的多糖（如肽聚糖和磷壁酸）有效地结合黄曲霉（Guan等，2021）。菌体通过细胞壁的特殊结构和成分、官能团之间的化学键、 大分子之间的作用力和表面张力等与黄曲霉毒素结合在一起， 形成微生物-毒素复合体。

酵母菌和乳酸杆菌具有良好的吸附能力和发酵能力， 因此它们在黄曲霉毒素脱毒过程中能发挥重要作用（Aazami 等，2018）。 布拉酵母菌具有良好的益生效果，楚杰（2013）发现布拉酵母菌脱除AFB1的主要机理是吸附作用， 在处理30 min，pH为8.0 时对AFB1去除率达到60%以上。 刘畅（2010）从传统自制发酵食品中分离到的11 种益生菌中， 发现菌株酿酒酵母Y1 对AFB1的吸附率可达32.11%， 经100 ℃加热灭活后， 吸附率显著上升，达到49.53%。 通过扫描及透射电镜观察，加热后菌体表面凹凸不平，细胞壁厚度增加，说明菌体加热后由于接触面积增加，提高了对AFB1的吸附能力。钱潘攀等（2017）用麝香草酚裂解并杀死酵母细胞，使细胞壁上肽聚糖的结构改变，提取酵母膜脂与细胞壁制成去毒剂，使其具有抑制黄曲霉孢子萌发和吸附毒素的双重能力。用薄层层析和液相色谱进行检测，发现该提取物对黄曲霉毒素的吸附能力为2.5 μg/mg。 Haidukowski（2019）将食用菌菌丝体制成新型的吸附剂，结果表明，杏鲍菇非活菌丝体对AFB1的吸附率能达到85%，采用因子设计模型（DOE）比较多个因素对吸附率的影响，并进行条件优化后，侧耳菌丝体吸附率达到90.7%。

革兰氏阳性菌的细胞壁中含有大量的肽聚糖、多糖和蛋白质，具有霉菌毒素吸附位点，故而成为吸附黄曲霉毒素的典型菌。 蒋采贝等（2019）研究了植物乳杆菌对AFB1的吸附能力和吸附特性，进行单因素试验确定最佳条件后，吸附率最大值为58%， 热致死菌体后对AFB1的吸附能力有明显提高， 表明在吸附过程中起作用的主要部位是细胞壁上的蛋白质和多糖等成分， 其多糖和肽聚糖对热处理敏感。 唐缨等（2020）从西北酸菜培养物中分离出20 株具有黄曲霉毒素脱除能力的菌株，脱除率为18.37% ～65.06%，将脱毒能力最强的菌株进行生理生化鉴定及16S rDNA 序列分析并构建系统发育树，鉴定为布氏乳杆菌。菌液离心后经PBS 多次洗脱后，AFB1逐渐释放， 菌株吸附率由65.06%逐渐下降至53.7%，说明该菌株对毒素的吸附取决于菌种自身的特异性， 虽然在过程中会有结合不紧密的毒素解离下来， 但是在多次洗脱后仍然保持较高的稳定性。

生物吸附是一种有效的去除黄曲霉毒素的方式， 通过菌体结合毒素可以达到高效去除毒素的目的，但在试验过程中，随着时间的延长，吸附率会逐渐下降， 与微生物结合不紧密的毒素会解离下来， 这表明吸附是一种可逆的过程。 Wacoo（2019）将饮料中提取的鼠李糖乳杆菌Yoba 和嗜热链球菌C106 制成发酵菌剂，30 ℃发酵24 h 能将黄曲霉毒素降低到无法检测到的水平， 体外荧光试验证实Yoba 细菌在该过程中与AFB1结合，但单靠吸附并不能达到这种效果， 推测其中既有菌体吸附，也有降解作用。

2.2 微生物对黄曲霉毒素的降解作用 近年来，国内外关于微生物降解黄曲霉毒素做了很多研究，金佳佳（2019）以香豆素为唯一碳源，从发酵食品、豆类、土壤、动物肠道及培养物中筛选出9 株能够去除黄曲霉毒素的菌株， 其中去除能力最高为90.7%，菌液与毒素反应后，经反复洗脱、萃取，萃取液中毒素的提取率极低，证明该菌株对AFB1有降解作用， 经生理生化及分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌。 董慧燕（2021）分离了一株对AFB1有降解能力的菌株， 经生理生化和分子生物学鉴定，为铜绿假单胞菌，编号M4，通过单因素试验和响应面优化试验确定最佳发酵条件， 将降解率从初始的34.10%提高到96.17%。 郭钰婷（2019）以香豆素为唯一碳氮源，从动物粪便、发霉的粮食、土壤中筛选出一株可以降解AFB1的绿脓杆菌，发现其对降解起主要作用的是上清液。 邱天宇（2020）从酱醅中筛选出一株具有降解黄曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株， 优化发酵条件后，对AFB1的降解率为95.01%， 且对花生粕中的四种黄曲霉毒素都具有较高的降解能力。 王海云（2013）从发霉的土壤和酒糟中取样，筛选出7 株菌， 其中4 种菌对AFB1的降解能力均在70%以上，经过鉴定，两种菌为芽孢杆菌，两种为短杆菌。

黄曲霉毒素的降解过程中， 共培养的菌株降解能力往往优于单一的菌株， 两种或多种菌株之间可能具有协同或互作。Wang（2013）从土壤样品中分离出两种菌，将其混合培养后并未相互抑制。两种菌株的上清液对毒素的降解率分别为30.2%和36.5%，共培养后上清液降解率达到87.7%，相比单独培养提高了对AFB1的降解率和降解速率，使上清液中蛋白含量和解毒酶含量升高，经鉴定，两种菌均为芽孢杆菌。王康（2020）测定两种芽孢杆菌的降解率为70.65%和61.42%， 将菌株组合并优化培养条件后降解率达到88.95%，说明结合菌株进行混合培养的效果高于单一菌株。

本团队早期研究通过使用液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-MS）及核磁共振氢谱，检测枯草芽孢杆菌WTX1 降解黄曲霉毒素后的产物，得到5 种主要产物，推测菌株降解作用于香兰素内脂环和戊烯酮环结构，并破坏呋喃环8，9 位的碳碳双键， 进行细胞毒理学试验得出降解后的产物对细胞形态、活性影响均不显著，说明此菌株具有显著解毒效果（唐璎等，2021；唐璎等，2021）。

2.3 降解AFB1的酶 菌体中的活性物质如肽、细菌素、有机酸、小分子有机物等对黄曲霉均有抑制、拮抗的效果（王昌禄等，2021），但在降解过程中，发挥作用的主要是菌体中的酶，其多存在于细胞内容物或胞外上清液中。近年来，利用真菌和细菌生物降解霉菌毒素已成为科研人员研究的热点， 微生物降解霉菌毒素的机理实质上就是在解毒酶作用下发生酶促降解，改变毒素的原始结构，形成低毒或无毒的新物质（纪俊敏等，2021）。

密环菌其产生的胞内酶AFO 是二肽基肽酶III（DPP III）家族的典型成员（Guan 等，2015），可以作用于AFB1的呋喃环的稀醚键并将其转化为环氧化物。 水解生成低毒的AFB1-8，9-二氢二醇以达到解毒的目的 （Wang 等，2019）。 Guan 等（2021）从玉米、水稻和土壤中分离出了能降解黄曲霉毒素的芽孢杆菌， 提取出一种降解酶（BADE），具有热稳定性，在70 ℃、pH 为8.0 时表现出最高的降解活性， 生成了新物质。 宋茂鹏等（2021）发现降解AFB1的主要活性物质位于假单胞菌的上清液中，HPLC 结果显示72 h 后AFB1峰面积明显小于对照组。 岳晓禹等（2017）发现嗜麦芽窄食单胞菌的胞外粗提液的降解能力最强，进一步研究发现该活性物质主要是菌株的胞外代谢产物，推测为胞外酶类。Wang 等（2017）从AFB1平菇菌丝悬浮液和黑曲霉的分生孢子的混合液中过滤提取出解毒酶， 分子质量分别为58 kDa 和63 kDa 的解毒酶对AFB 具有较高的降解性。 通过液相色谱-质谱的方法联用确定了8 种降解产物的具体成分和结构公式，其毒性都较小或无毒，证明混合真菌培养物促进了解毒酶的产生， 这可能比单独的菌株降解AFB1更有效。 李文明（2013）用施氏假单胞菌内的物质，用液相色谱串联质谱法，AFB1生成两种新物质。

在具有降解能力的菌株中， 许多酶对黄曲霉毒素具有较强的降解能力， 包括水解酶（Alberts等，2009）、过氧化物酶（Yehia 等，2014）、氧化还原酶（Xu 等，2017；Li 等，2019）。AFB1包含呋喃部分和内酯环部分。 末端呋喃环上的双键是AFB1癌症和毒性的关键活性位点（贺冰，2016）。酶可以直接或间接作用于末端呋喃环中双键或碳位点，降低或消除毒性（Wajiha 等，2016）。

漆酶已被证实具有对黄曲霉毒素的降解能力（姜宏等，2021），其作用于黄曲霉毒素的二呋喃环对其直接氧化（卢丹等，2018）。真菌锰过氧化物酶可以降解包括黄曲霉毒素在内的四种真菌毒素，Wang（2019）从枯草芽孢杆菌中克隆出染料脱色过氧化物酶（DYP）基因，在大肠杆菌BL21 中表达，重组BsDyP 可以有效地降解AFB1，其在48 h内被纯化的BsDyP 降解至76.93%， 降解后AFB1呋喃环8，9 号位的碳碳双键被氧化， 加上两个羟基生成醇， 生成的AFB1-二醇的毒性小于AFB1。Qin（2021）发现在二羧酸丙二酸盐存在下，八种锰过氧化物能够降解四种主要的霉菌毒素， 包括AFB1，其中自由基起重要作用。 但锰过氧化物酶（MnPs）难以大量获得，可以在毕赤酵母（Jiang 等，2008）或丝状真菌（Conesa 等，2002）中获得，然而它们很难重组表达， 如未来可以把精力放在基因工程中常用的平台工业微生物上，或可促进MnPs的大规模异源生产。

酶不易保存， 随时间变化酶易钝化， 失去活性。 降解酶的产生与分泌是否受毒素的诱导，单独的酶对毒素的降解能力不如宿主菌株有效，因此真菌毒素的降解往往需要几个或多个酶协同并发挥作用，且降解途径并不明确，其具体机制还需要深入研究。 另外，在实际操作中存在一定难度，是否能够将降解酶混合或制成制剂大批量生产投入应用，还有待进一步研究。

3 结论与展望

花生、玉米、小麦等众多粮食在储存与运输过程中都会受到黄曲霉毒素的污染， 其毒性与致癌性极强，通过食物链的传递，危害牲畜与人类的健康。 因此研究一种高效、环保、安全的去毒方式和防控策略势在必行。

黄曲霉毒素由黄曲霉菌和寄生曲霉产生，受到光照、温度、湿度等环境因素影响，在此基础上寻找一种能保持粮食营养价值的去毒方法应用于农业迫在眉睫。 现有的物理法包括加热、吸附、紫外线照射、超声和低温等离子体技术等方式，去除毒素速度快，但降解不彻底，有残留。 化学法通过化学反应将毒素转化为低毒或无毒产物， 常用的方法有强酸强碱处理法、臭氧熏蒸法、电解水技术等。化学法降解彻底，但操作复杂，成本高，且化学药品的残留容易发生二次污染，不能达到绿色、安全的期望。 生物去除法通过微生物细胞壁等特殊结构吸附毒素，将粮食与毒素分离；或通过微生物的生长特性， 利用黄曲霉毒素作为自身生长的碳源，达到降解的目的。生物去除方法可以有效的去除毒素并保证食品品质，无毒无害，有很强的特异性和生物安全性。

因此利用微生物去除黄曲霉毒素是最有潜力和发展前景的方法， 筛选出对黄曲霉毒素具有高效拮抗作用的菌株是防治毒素污染领域研究的热点之一，研究发现芽孢杆菌、假单胞菌、乳酸菌、酵母菌等对黄曲霉毒素有拮抗作用， 分离出微生物中的活性物质， 并进一步研究以阐明黄曲霉毒素的降解机制， 是今后防治真菌毒素污染应用的重要基础研究工作。