中草药混菌固态发酵玉米秸秆饲料及工艺条件的研究

蒋 鑫， 沈 旭， 吴 波， 庄 勇， 刘林培， 何明雄

（1.成都理工大学生态环境学院，四川 成都 610059；2.农业农村部沼气科学研究所，农业农村部农村可再生能源开发与利用重点实验室，生物质能技术研究中心，四川 成都 610064）

玉米秸秆具有种植面积广、 数量大及可生物降解等优势，是畜牧业饲料的原料之一。根据农业农村部《全国农作物秸秆综合利用情况报告》统计显示，2021 年玉米秸秆产生量达到3.21 亿t，位居农作物秸秆产生量第一。 而以往大部分玉米秸杆被直接还田或焚烧， 这给环境带来了严重的负面影响，因此如何变废为宝，高效率低成本地利用玉米秸秆， 已成为我国当前生物质资源利用领域的研发热点。 目前玉米秸秆的绿色处理方式主要包括肥料化、饲料化及能源化等（Xu 等，2020；Gang等，2020）。随着畜业的迅猛发展，饲料短缺已成为严重制约反刍动物生长的重要因素。 玉米秸秆含有较高的纤维素、半纤维素和木质素，若直接进行饲喂，消化利用率低，但经过微生物发酵后，玉米秸秆粗蛋白质含量增加，粗纤维含量减小，改善饲料适口性促进牲畜的生长并增强牲畜的免疫能力（伍玉鹏等，2022；Ren 等，2020）。高效率低成本地利用玉米秸秆为制作粗饲料来源提供巨大保障，一定程度上能够缓解人畜争粮及减少农村环境污染等问题（刘海燕等，2016）。

固态发酵期间， 大量腐败微生物和不良微生物的滋生对发酵质量带来极大的风险。 目前已有研究表明， 在黄贮或青贮制备中添加一定量的中草药能够显著地降低这种风险（Liu 等，2011）。黄芪、马齿觅等中草药中含有多糖、类黄酮、酚类化合物、精油等生物活性物质，其对多种真菌和细菌具有显著的抑制作用 （Qla 等，2021；Falleh 等，2020）。在紫花苜蓿中添加含有类黄酮和多糖等活性物质的中药材，如黄芪、山楂等进行共青贮能够抑制梭菌、肠杆菌及真菌，促进乳酸菌的生长，进而提高青贮品质（Ni 等，2020；Hashemi 等，2011）。He 等（2020）将辣木叶与稻草进行共青贮不仅能够促进乳酸菌的生长， 也保障了青贮饲料的发酵品质和营养。 此外，Li 等（2022）发现，黄芪、马齿觅等36 种中草药与紫花苜蓿进行混合发酵能够提高发酵体系中乳酸的浓度和乳酸杆菌的丰度。吕慧源等（2019）使用中草药混合发酵后能够显著提高粗蛋白质含量。

本研究所使用的中草药（黄连、黄芪、黄芩、马齿觅、山银花、雪胆、地黄）也含有丰富的多糖、类黄酮、酚类化合物、精油等生物活性物质，在农业农村部第194 号文件要求全面“禁抗” 的大环境下，可作为一种新型的饲料添加剂，具有与抗生素得相似或相同的功效，符合无抗养殖的要求。蛋白含量是饲料的一项重要指标， 粗蛋白质中包含蛋白质含量和非蛋白含量， 不能反映饲料的真正营养价值， 因此本研究在饲料发酵过程中主要探究尿素含量、含水量、菌液添加量、葡萄糖的添加量对饲料真蛋白含量的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 试验原料与辅料 玉米秸秆、 豆粕由中国农业科学院沼气科学研究所提供，中草药（黄连、黄芪、黄芩、马齿觅、山银花、雪胆、地黄）由成都中医药大学提供。 玉米秸秆用切碎机切至2 ～4 cm进行后续试验。

1.1.2 试验菌种 枯草芽孢杆菌（ACCC 19743）、植物乳杆菌（CICC 21804）购自中国农业微生物菌种保藏管理中心， 运动发酵单胞菌ZM-D95（GDMCC 60582）、酿酒酵母（CICC 32632）为农业农村部沼气科学研究所秸秆资源化利用创新平台保藏菌株。 枯草芽孢杆菌采用LB 培养基30 ℃、150 r/min 进行培养， 植物乳杆菌采用MRS 培养基30 ℃进行静止培养，运动发酵单胞菌ZM-D95采用RM 培养基30 ℃进行静止培养、酿酒酵母采用YPD 培养基30 ℃、150 r/min 进行培养。

1.2 主要仪器 凯氏定氮法仪 （KD-310 OPSIS公司）、石墨消解炉（SH220F 海能未来技术集团股份有限公司）、恒温振荡培养箱（THZ-98AB 一恒科学仪器有限公司）、 高效液相色谱仪（Agilent 1200 series 安捷伦科技有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱 （DHG-914OA 上海齐欣科学仪器有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（HVA-85 Sanyo 公司）、垂直层流洁净工作台（HCB-1300V 海尔集团）、紫外分光光度计 （DU800 Beckman 贝克曼库尔特公司）、 酶标仪（美谷Molecular Devices 公司）、BioLector Ⅱ（贝克曼库尔特公司）、粉碎机（BJ-300A德清拜杰电器有限公司）、 恒温培养箱 （HZQX300 一恒科学仪器有限公司）、pH 计（FE28 梅特勒-托利多仪器有限公司）

1.3 主要试剂

1.3.1 培养基配方 RM 培养基：20.00 g/L 葡萄糖，10.00 g/L 酵母提取物（YE），2.00 g/L（NH4）2SO4，2.00 g/L KH2PO4，1.00 g/L MgSO4，若需要RM 固体培养基则需另添加15 g/L 的琼脂。

MRS 培养基：蛋白胨10 g/L；牛肉浸粉8 g/L；酵母浸粉4 g/L；葡萄糖20 g/L；磷酸二氢钾2 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L； 乙酸钠5 g/L；硫酸镁0.2 g/L；硫酸锰0.04 g/L；吐温-80 1 g/L；若需要固体培养基则需另添加15 g/L 的琼脂。

PDA 培养基：马铃薯浸粉5 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L；氯霉素0.1 g/L。

YPD 培养基： 蛋白胨20 g/L； 酵母提取物10 g/L；葡萄糖20 g/L；若需要YPD 固体培养基则需另添加15 g/L 的琼脂。

LB 培养基：酵母提取物10 g/L；胰蛋白胨5 g/L；氯化钠5 g/L。 若需要LB 固体培养基则需另添加15 g/L 的琼脂。

麦康凯培养基：琼脂15 g/L，蛋白胨20 g/L；氯化钠5 g/L；乳糖10 g/L；结晶紫0.001 g/L；中性红0.03 g/L；3 号胆盐10 g/L； 上述YPD 培养基、PDA 培养基、MRS 培养基、RM 培养基在115 ℃灭菌20 min， 麦康凯培养基和LB 培养基在121 ℃灭菌15 min。

1.3.2 试验药品 三氯乙酸、氢氧化钠、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、盐酸、浓硫酸、蒽酮、亚硝基铁氰化钠、葡萄糖、酵母提取物、高效凯氏定氮催化片、琼脂等均为分析纯级别。

1.4 试验方法

1.4.1 单因素试验 将2 ～4 cm 干玉米秸秆加入5%中草药（m/m）、5%豆粕（m/m）、复合菌液（植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、运动发酵单胞菌，1：1：1：1）和葡萄糖，调整含水量，混合均匀按照150 g/袋，装填至真空袋中，由真空机抽去空气，30 ℃培养箱中密封发酵30 d， 各组试验均重复三次。 发酵结束后进行取样，将样品烘干，经过除去非蛋白氮后进行凯氏定氮法测定蛋白质的含量， 以发酵过程中的真蛋白含量为指标确定最佳发酵条件。

1.4.2 正交试验设计 在单因素试验基础上， 以水分含量、菌液添加量、葡萄糖的添加量作为变量因素设计三因素三水平L9（33）正交试验进行发酵条件优化，以此来确定玉米秸秆饲料最佳发酵工艺条件。

1.4.3 正交结果验证 将正交试验优化得出的最佳发酵条件再次进行发酵，测定其真蛋白含量，并与正交试验结果对比，确定其含量是否相近，验证单因素试验和正交试验之间的可靠性。

1.4.4 添加中草药对饲料的影响 取2 ～4 cm干玉米秸秆加入5%的豆粕 （m/m）、5%复合菌液（植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、运动发酵单胞菌，1：1：1：1）（V/m）、按照正交所得到的最佳发酵条件进行发酵，一组添加5%组方中草药（m/m），另外一组以不添加中草药作为对照组，充分混合均匀，按照150 g/袋，装填至真空袋中，由真空机抽去空气，30 ℃培养箱中密封发酵30 d，各组试验均重复三次。发酵结束后测定真蛋白、粗蛋白质、有机酸含量以及相关微生物的数量。

1.5 指标测定及方法 称取发酵后的饲料样品20 g，加入180 mL 无菌水充分混合，混匀后在4 ℃下悬浮过夜，然后采用四层粗棉布过滤，最后所得滤液用于pH、氨氮和有机酸的含量测定。 氨氮采用Broderick 等（1980）报道的方法进行测定。 pH通过pH 计进行测定。 有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）采用高效液相色谱法（HPLC）分析。 该系统使用Aminex HPX-87H 色谱柱（300 mm×7.6 mm，安捷伦科技有限公司），HPLC 分析条件为： 流动相：0.05 mol/L H2SO4，流速：0.6 mL/min，柱温：55 ℃，检测器：示差检测器，进样品体积：20 μL。

另取40 g 发酵完成的饲料样品， 放置于65 ℃通风烘箱 （DHG-914OA 上海齐欣科学仪器有限公司）干燥48 h 确定干物质（DM）含量，并研磨烘干样品至能通过1 mm 筛子， 然后进行蛋白质组分测定。 测定之前先采用10%三氯乙酸进行预处理， 再按照国标GB/T 6432-2018 方法进行测定。可溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸法进行测定（Hasan，2015）。纤维素、半纤维素采用两步酸水解法进行测定（Sluiter 等，2010）。

对于微生物菌数的测定， 取20 g 已发酵好的样品与180 mL 无菌盐水（0.85% NaCl）均匀混合，并连续稀释（10-1、10-2、10-3）分别涂布于不同培养基上，30 ℃培养2 d 后进行细菌计数； 将稀释10-3的稀释液涂布到添加0.1 g/L 放线菌酮的MRS 琼脂培养基上，以计数乳酸菌（LAB）数量；添加氯霉素的PDA 培养基上计数酿酒酵母和霉菌数量，在麦康凯培养基上计数大肠菌属数量。菌落数为每克新鲜物质（FM）的菌落形成单位（CFU）中的细菌存活数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验对玉米饲料真蛋白含量的影响

2.1.1 尿素添加量对玉米饲料真蛋白含量的影响发酵条件如1.4.1，对照组（CK）不添加尿素；试验组添加1%、2%、3%（m/m）的尿素；真蛋白与粗蛋白质含量测定结果见图1。

图1 尿素添加量对玉米秸秆饲料真蛋白和粗蛋白质含量的影响

试验结果表明，发酵结束后，在添加尿素后粗蛋白质的含量先增加后减小， 在添加量为1% 时达到最高，与对照组相比提高了19.52%并且差异显著（P＜0.05）（图1a），而真蛋白含量先减少后增加，对照组的含量最高，但各组差异不显著（P＞0.05）（图1b）。

2.1.2 尿素含量对玉米饲料pH 和有机酸的影响表1 中测定结果显示，随着尿素添加量的增加pH也随之增加， 添加量超过1%时，pH 高于4.5，差异显著（P＜0.05），以往的研究表明饲料的有效保存pH 在4.5 以下。 乳酸作为饲料中的有益物质，其含量先增加再减小， 在尿素添加量为1%时达到最大，乳酸对比对照组提高了22.78%也具有统计学差异（P＜0.05），尿素添加量为1%时比较适宜。另外有研究表明，丁酸出现在饲料中是一种能量浪费代谢，在饲喂时会影响牲畜的采食率，其含量大于5 g/kg 会影响动物健康 （Muck，2010；Thomas 等，1991）。本试验结果中仅对照组和添加量为1%时丁酸含量小于5 g/kg。 综上所述真蛋白、粗蛋白质以及有机酸的含量，最终确定尿素的添加量为1%，这与Santos 等（2018） 得到的尿素最佳添加量结果相一致。

表1 尿素添加量对玉米秸秆饲料pH 和有机酸含量的影响

2.1.3 含水量对玉米秸秆饲料真蛋白含量的影响发酵体系中含水量对玉米秸秆饲料蛋白含量具有明显的影响，发酵条件如1.4.1，调整每组中的水分含量为50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%；其真蛋白含量结果如图2 所示。

图2 含水量对秸秆饲料真蛋白含量的影响

结果表明， 当含水量由50%升高到65%，真蛋白含量由6.69%增加到6.86%； 而含水量由65%升高到80%， 真蛋白含量由6.86%下降到6.57%。 这表明含水量对真蛋白含量具有显著影响（P＜0.05），推测可能由于水分含量影响了细菌在该环境中的生长繁殖。 此外， 试验结果表明，65%含水量是该环境下的发酵最佳含量。因此，选取60%、65%、70%含水量进行发酵优化。

2.1.4 菌液添加量对饲料真蛋白含量的影响 发酵条件如1.4.1，对照组（CK）不接种菌液；试验组接种1%、2%、3%、4%、5%的复合菌液（植物乳杆菌、枯芽孢杆菌、酿酒酵母、运动发酵单胞菌按照1：1：1：1）；其结果图3 所示。

图3 菌液添加量对玉米秸秆饲料真蛋白含量的影响

结果表明，菌液添加量从0% ～2%，真蛋白含量由6.10%增加到6.80%； 添加量从2% ～5%时，真蛋白含量由6.80%下降至6.49%。 这表明菌液添加量对真蛋白含量也是具有明显的影响（P＜0.05）。 试验结果显示，2%的菌液添加量对于真蛋白含量的影响最为显著（P＜0.05），其真蛋白含量对比对照组提升11.64%， 因此选择1%、2%、3%进行后续条件优化。

2.1.5 葡萄糖含量对玉米秸秆饲料真蛋白含量的影响 发酵条件如1.4.1，对照组（CK）不添加葡萄糖；试验组添加4%、6%、8%、10%（m/m）的葡萄糖。其结果如图4 所示。

图4 葡萄糖添加量对玉米秸秆饲料真蛋白含量的影响

试验结果显示， 随着葡萄糖添加量的增加（0% ～10%），真蛋白含量变化呈现先上升后下降的趋势； 其中6%葡萄糖添加量时真蛋白含量最高， 相较于对照组其真蛋白含量增加19.68%，具有显著差异（P＜0.05）。 这表明6%葡萄糖添加量更加适合用于发酵。 因此选择4%、6%、8%的葡萄糖添加量进行后续条件进一步优化。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果分析 将上述所得到的优化条件含水量60%、65%、70%， 菌液添加量1%、2%、3%，葡萄糖添加量4%、6%、8%进行正交试验设计，如表2 所示。

表2 正交试验设计与结果

由表2 可知， 三个因素对真蛋白含量的影响程度依次为含水量＞葡萄糖添加量＞菌液接种量，最佳发酵工艺条件为A3B3C3，即含水量为70%，葡萄糖含量为8%，菌液添加量为3%。

2.2.2 正交试验结果验证 以正交试验所得最佳发酵条件含水量70%，葡萄糖含量8%，菌液添加量3%进行发酵。 发酵结束后进行取样， 样品烘干， 经过除去非蛋白氮后进行凯氏定氮法测定真蛋白质的含量，测得其真蛋白的含量为7.47%；这与正交试验结果的真蛋白含量结果具有一致性，表明组方中草药混菌固态发酵玉米秸秆饲料工艺单因素试验和正交优化试验结果可靠。

2.3 组方中草药对玉米秸秆饲料的影响 发酵工艺如2.2，其余发酵条件如1.4.1。 对照组（-TCH）不添加中草药；试验组（+TCH）添加5%（W/W）的中草药。 将发酵结束的饲料样品进行后续微生物计数、pH 和有机酸含量以及饲料品质成分测定。

2.3.1 中草药对微生物群落的影响 从表3 中可以看出，试验组（+TCH）中乳酸菌数比对照组（-TCH）的乳酸菌数量更多，增加15.10%，具有显著的差异 （P＜0.05）， 这与He 等 （2020）、Liu 等（2011）结果一致；而对照组（-TCH）霉菌和大肠菌属的数量虽均高于试验组（+TCH），但不具有显著性差异（P＞0.05）。 这可能是由于添加中草药后能够促进乳酸菌的生长（杨君等，2009），而乳酸菌不仅能够产生大量的乳酸，还能分泌一些抗菌肽，进而抑制该环境中霉菌、 酿酒酵母以及大肠菌属等腐败菌的滋生，起到了稳定发酵体系的作用。

表3 中草药对饲料微生物的影响lg CFU/g FM

2.3.2 中草药对玉米秸秆饲料pH 和有机酸的影响 表4 中试验结果表明，试验组（+TCH）乳酸含量比对照组（-TCH）更高，对比对照组（-TCH）提高了17.84%，这也与前面试验组（+TCH）乳酸菌的数量比对照组 （-TCH） 高相一致， 试验组（+TCH）pH 也更低。

表4 中草药对饲料成分的影响

2.3.3 中草药对玉米秸秆饲料品质的影响 从表5 中可以看出，试验组（+TCH）中粗蛋白质、真蛋白含量以及干物质量比对照组（-TCH）分别提高21.69%、10.93%、0.5%，但均不具有统计学上的显著性差异（P＞0.05）；添加中草药后能够确保发酵体系更稳定，营养物质对比对照组（-TCH）含量更高且保存更完好。同时试验组（+TCH）中纤维素和半纤维素含量比对照组（-TCH）分别降低3.10%和4.52%， 这可能是添加中草药后抑制了腐败菌的滋生，确保了枯草芽孢杆菌的生长与发酵环境，而其分泌产生的纤维素酶降解纤维素， 降低了纤维素和半纤维素含量； 另外一个原因可能是由于尿素对纤维素和半纤维素也具有部分溶解作用（伏桂华等，2021）。

表5 中草药对饲料品质的影响

3 结论

本研究通过设计正交试验优化混菌固态发酵玉米秸秆饲料的最佳工艺条件为： 含水量70%，葡萄糖添加量8%，菌液添加量3%，尿素添加量1%。该条件下混菌固态发酵玉米秸秆饲料中真蛋白含量为7.47%， 且添加中草药后能够增加乳酸菌数量和乳酸含量， 进而抑制腐败菌霉菌和大肠菌属的滋生， 同时也降低了纤维素和半纤维素的含量。 因此， 饲料发酵中添加中草药进行混合固态发酵对于提高饲料质量具有相当的可行性。