枯草芽孢杆菌发酵银杏叶制备饲料添加剂的工艺研究

宋立立 ， 董旭芳， 张连水

（1.沧州师范学院生命科学系，河北 沧州 061001；2.河北省水产养殖微生物菌剂技术创新中心，河北 沧州 061001）

目前，人们饮食和保健意识日益升高，在选择食用禽类、畜类产品时，越来越注重安全、保健及无农药残留。 而抗生素在动物饲料的泛滥使用严重危害动物及人类健康，因此发酵安全饲料产品，利用合适的方法发酵禽畜饲料已成为当前重点任务（高树封，2014）。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤或腐败物中，作为一种需氧型革兰氏阳性菌，是一种实验室及工业饲料常用菌种（杜晓雨等，2020）。此菌种也广泛应用在改善动物肠道菌群方面（卢超等，2020）。 利用枯草芽孢杆菌发酵饲料可以产生大量活性物质， 从而促进转化吸收和增强动物机体免疫力（苏伟光，2020），并且研究表明用发酵饲料饲养的反刍动物效果更明显（白海等，2020）。

银杏属银杏科银杏属， 银杏树作为我国特有速生珍贵药用植物多地区均有栽培。 银杏叶及其提取物中含大量黄酮、有机酸、多酚、多糖及氨基酸等活性物质，药用价值广泛，作为禽畜类饲料的优选来源，为动物的代谢及生长提供营养（李志平等，2021；宋立立等，2020）。 但若直接将银杏叶添加到饲料中饲养动物，因口感味道不佳，动物取食性不高（高树封，2014）。本试验采用从银杏叶粉当中直接提取黄酮、多酚、多糖与枯草芽孢杆菌实验室固态发酵银杏叶，优化发酵工艺条件，在最适发酵工艺条件下测定黄酮、多酚及多糖的含量对比，旨在改善银杏叶口感来喂养动物。 一方面发挥银杏叶的价值，另一方面提高家禽、家畜的生产率及产品安全性， 为以后工业微生物发酵银杏叶制备饲料添加剂做出理论指导。

1 试验材料及设备

1.1 试验菌株 枯草芽孢杆菌（保藏菌种）。

1.2 试验材料及药品试剂 试验材料： 银杏叶粉、豆粕、麸皮；药品试剂：牛肉膏、琼脂、酵母膏、蛋白胨、L-酪氨酸、干酪素、吐温（20、40、60、80）、无水乙醇、NaOH、HCl、NaCl、NaNO2、Al （NO3）3、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、福林酚试剂、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等。

1.3 培养基 斜面培养基： 牛肉膏、 蛋白胨、琼脂、NaCl。 种子培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%（m/V）、pH 7.4、121 ℃灭菌20 min。 基础发酵培养基：每个锥形瓶内银杏叶粉7 g、豆粕1.5g、麸皮1.5 g、营养液20 mL、121 ℃灭菌30 min。接菌量5%。 营养液：蛋白胨10.0 g/L、K2HPO46.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、酵母膏0.4 g/L、自然pH。

2 试验方法

2.1 菌株活化和培养 将实验室的菌种转接于固体培养基， 置于恒温培养箱37 ℃条件下培养22 h，使其活化。活化好的接种于种子培养基37 ℃、160 r/min 进行培育， 之后以5%接种量接种于固态发酵培养基进行发酵。

2.2 粗酶液的制取 将产物至于室内通风处风干， 用分析天平量1 g 样品至100 mL 锥形瓶中，20 mL 无菌生理盐水和3 颗无菌小球， 放置摇床37 ℃、200 r/min 条件下30 min 后进行离心，得粗酶液。

2.3 蛋白酶活测定 以酪蛋白为底物，参照国标Folin-酚法测定蛋白酶活性（杨旭等，2014）。

酪氨酸标准曲线绘制：取适量L-酪氨酸和蒸馏水，配制浓度为0.1 mg/mL 的L-酪氨酸标准溶液， 分别取0、1、2、3、4、5、6 mL 标准溶液定容至10 mL。 分别依次加入NaCO3、Folin-酚试剂，摇匀，放入水浴锅内。 显色20 min 后，测OD 值。 绘制标准曲线， 得回归线方程：y=0.0466x+0.0233，R2=0.9969。

2.4 单因素试验 以蛋白酶的活性为指标，探究固态发酵银杏叶的温度、时间、接菌量、营养液酸碱度以及表面活性剂因素的关系。

2.4.1 发酵温度对发酵产品中酶活力的影响 参照原始条件，分别设置四批发酵，温度分别为31、34、37、40 ℃。 做三组平行，检测每个发酵温度条件下培养基的蛋白酶活， 确定培养基的最适发酵温度。

2.4.2 发酵时间对发酵产品中酶活力的影响 参照原始条件，设定发酵时间分别为24、36、48、60 h，做三组平行， 检测每个发酵时间条件下培养基蛋白酶活，确定培养基的最适发酵时间。

2.4.3 接种量对发酵产品中酶活力的影响 参照原始条件，改变接菌的数量分别为6%、8%、10%、12%，做三组平行。分别检测各种条件下的蛋白酶性质，确定出发酵条件的最适接菌数量。

2.4.4 营养液pH 对发酵产品中酶活力的影响参照原始条件， 改变营养液酸碱度的值分别为6.5、7.0、7.5、8.0。 分别检测各种条件下蛋白酶活，从而找出最优的发酵酸碱度（冒鑫哲等，2020）。

2.4.5 不同表面活性剂对发酵产品中酶活力的影响 参照基础发酵培养基，分别添加0.5%的不同系列吐温；分别检测不同系列吐温下的酶活力，确定出培养基的最适发酵活性剂（王东等，2016）。

2.5 黄酮、多酚含量的提取及测定方法

2.5.1 黄酮、多酚提取方法 分别取出3 g 发酵后的产物和银杏叶粉，以C2H5OH 作为萃取剂，在1:30的料液比条件下180 W 超声30 min，将所得混合液进行抽滤， 即得到待测样品溶液 （成宏斌等，2021）。

2.5.2 黄酮含量的测定 量取待测液5 mL 于玻璃试管中。 各试管中分别加入1 mL 亚硝酸钠摇匀静置6 min。 加入1 mL 硝酸铝溶液，摇匀放置6 min，再加入NaOH 10 mL，用蒸馏水定容至25 mL，放置15 ～20 min。 设置波长为510 nm，测OD 值（A）。 根据y=8.3884x+0.002，R2=0.9993 得黄酮浓度，计算含量（图1）。

2.5.3 多酚含量得测定 没食子酸标准曲线：取没食子酸配制浓度为0.1 mg/mL 的液体。 用仪器分别取0 ～1.0 mL （等差为0.2 mL） 溶液于试管中， 分别添加1 mL Folin-酚试剂， 摇匀放置5 min。 加入NaCO33 mL，混匀定容至10 mL。 遮光30 min，760 nm 处测吸光度（姜湘英等，2020），得出回归方程y=189.1x-0015， 相关系数R2=0.9978（图2）。 取样品1 mL 于试管，空白管加蒸馏水做对照，分别添加1 mL Folin-酚试剂、20%NaCO33 mL，定容至10 mL。摇匀遮光30 min。将测得的OD 值代入方程得多酚浓度，找出含量。

图2 没食子酸标准曲线

2.6 多糖的提取及测定 取葡萄糖配制成0.04mg/mL溶液，分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于8 支试管， 分别加水至2.0 mL， 添加1 mL 苯酚，混匀。再加入浓H2SO4，静置20 min，测OD 值。曲线图和方程见图3。

图3 葡萄糖标准曲线

分别称取2 g 发酵产物和银杏叶粉，加入20 mL蒸馏水煮沸1 h， 八层纱布过滤后5000 r/min 离心。 取上清液加等体积20% CCl3COOH 后摇匀于冰箱冷藏30 min。 高速离心后取上清液按1：4 加入80% C2H5OH， 混匀放置24 h。 继续离心留沉淀，用无水C2H5OH 洗下并烘干。 将干燥后的物质溶解至100 mL， 取2 mL 液体， 加入6%苯酚1 mL，混匀。 添加浓H2SO4，依照葡萄糖标准曲线方法，测OD 值代入方程，查出浓度，计算多糖含量（秦令祥等，2018）。

3 结果分析

3.1 单因素分析

3.1.1 发酵温度对蛋白酶活力的影响 由图4 可见，从31 ℃到37 ℃，随着发酵温度的上升，蛋白酶活逐渐升高。 到37 ℃表现最高酶活力为42.41 U/mL。继而随着培养箱设置温度越来越高， 酶活力开始逐渐下降。 由此确定发酵银杏叶最合适的培养箱温度为37 ℃。

图4 温度对蛋白酶活的影响

3.1.2 时间对蛋白酶活力的影响 设定发酵培养时间分别为20 ～60 h（等差为12 h）四个梯度，从前两天的48 h 期间，活力显著提高，随着发酵培养时间继续延长至60 h， 蛋白活力由最高46.98 U/mL 下降至40.55 U/mL。由此确定枯草芽孢杆菌影响银杏叶发酵的最佳时长为48 h（图5）。

图5 发酵时间对蛋白酶活的影响

3.1.3 接种量对蛋白酶活力的影响 改变种子液接菌数量， 发现不同接种量相对于发酵时间和温度来说， 其对酶的活力影响较大。 从6%升高到10%的接菌标准时，酶活力持续上升。接菌数量达到10%的时候，活力达顶峰为83.64 U/mL（图6）。随着接菌量的提高， 推测锥形瓶内营养或氧气含量不足，其可能为酶活变低的原因。 由此，可确定出发酵培养时接菌的数量为10%。

图6 接种量对蛋白酶活的影响

3.1.4 营养液pH 对发酵产品中酶活力的影响由图7 可知， 关系到蛋白活力的最显著营养液酸碱度为7.5。 调节不同pH，由pH 6.5 时的蛋白酶活为44.36 U/mL，营养液pH 调节到7.5 时的蛋白酶活为64.36 U/mL。 继续提高酸碱度为8 时，蛋白酶活反而下降。

图7 营养液pH 对蛋白酶活的影响

3.1.5 活性剂对发酵产品中酶活力的影响 由图8 可知， 不同系列的吐温产品对蛋白酶活的影响不明显，添加吐温-20、吐温-40、吐温-60 发酵条件下，测得蛋白酶活相似。 吐温-80 效果较显著，此时蛋白酶活力为53.61U/mL。

图8 表面活性剂对蛋白酶活的影响

3.2 响应面结果分析 通过单因素试验结果比较发现， 对发酵银杏叶的结果影响最显著的三个因素，分别为接种量、营养液pH 和发酵时间。 因此， 借助Desgin Expert 11 软件对响应面进行设计，进而对三因素三水平进行分析（表1）。

表1 响应面因素与水平

对枯草芽孢杆菌发酵银杏叶产酶的三个因素进行17 组分析试验， 继续测定蛋白酶活。 使用Desgin Expert 11 对测验所得的响应值蛋白酶活力进行二次多变量回归拟合，得二次多元方程为Y =103.86 +0.24A -0.4025B +1.6C -0.885AB -1.84AC+0.755BC-6.82A2-9.08B2-3.72C2。 其中Y为预测的蛋白酶活值，A 为接种量，B 为营养液pH，C 为发酵时间。

根据软件分析结果显示，如表2，预测蛋白酶活的最大值可达到104.033 U/mL，各因素分别为A=-0.0103%、B=-0.0124、C=0.2149， 换算实际值为：接种量9.9763%、营养液pH 7.4924、发酵时间50.6633 h。

表2 响应面试验设计分析

3.2.1 回归分析 针对二次多变量回归方程显著性和方差结果进行分析（表3）。 此模型P=0.0005（P＜0.01），拟失项P=0.8503（P＞0.05）。 此结果可以得出结论，此模型回归极为显著，而拟失项不显著。该模型的R2=0.9572，表示拟合程度较好，可以准确预测不同发酵条件下所产生的蛋白酶活。

表3 二次模型方差分析

3.2.2 各因素等高线图和响应曲面 使用软件Design-Expert 11 对三个因素分析， 导出关于接种量、营养液pH 以及时间三个因素之间模型的等高线图和响应曲面图。交互作用的显著性可以利用等高线图来反映。 等高线图结果显示越扁，代表交互作用越显著；等高线图越近乎圆环时，则代表其交互作用不显著（陈作国等，2018；王东等，2016）。

因此由图9 ～11 可以看出， 交互作用中，营养液pH 和发酵时间最为显著， 接种量和发酵时间影响次之，而接种量和营养液pH 则最不显著。

图9 接种量-营养液pH影响蛋白酶活等高线图、响应曲面图

图10 接种量-发酵时间影响蛋白酶活等高线图、响应曲面图

图11 营养液pH-发酵时间影响蛋白酶活等高线图、响应曲面图

3.3 验证试验 为了检测模型预测结果的可靠性，采用优化后近似值的培养基（接种量10%、营养液pH 7.5、发酵培养时间50.67 h）做3 组平行发酵试验， 并继续测定枯草芽孢杆菌发酵银杏叶培养基的蛋白酶活力大小， 结果分别为104.48、101.19、100.38 U/mL，平均值为102.02 U/mL。 验证结果表明， 发酵后测得蛋白酶活实际值与此响应面优化预测值相差较小。 该优化后的模型非常好地预测了实际蛋白酶活力值，预测结果可信。

3.4 最优发酵产物及直接测定银杏叶黄酮、多酚、多糖含量 结合单因素试验，选取最优条件下的发酵培养基，再次进行发酵试验。取发酵产物和银杏叶粉，提取并测定黄酮、多酚、多糖三者的含量。 结果表明，最优发酵条件下，黄酮、多酚、多糖含量分别为13.94、1.2、6.26 mg/g；对银杏叶粉直接提取黄酮、多酚、多糖，其三者含量分别为15.43、1.37、7.2 mg/g。

4 结论

枯草芽孢杆菌发酵银杏叶制备饲料添加剂，可以很好地利用银杏叶的价值。 黄酮类化合物可以促进动物生长发育， 影响动物体内性激素的分泌和代谢及其他激素的调节，可提高免疫机能，促进健康。 多酚可以改善动物生产性能、预防疾病，属于纯天然无污染无耐药性的抗生素代替物，多糖可以提高饲料的适口性。

本试验通过对银杏叶粉直接提取黄酮、多酚、多糖并测定其含量， 以及利用枯草芽孢杆菌进行实验室固态发酵， 改变发酵工艺进行单因素试验初步对发酵条件进行优化，利用Design-Expert 11软件对单因素试验结果进一步优化。 最终得出结果，对银杏叶粉直接提取黄酮、多酚、多糖，其三者含量分别为15.43、1.37、7.2 mg/g；枯草芽孢杆菌发酵银杏叶的蛋白酶活最佳条件为接种量9.98%、营养液pH 7.49、发酵培养时间50.66 h，结合单因素试验， 发酵温度为37 ℃， 表面活性剂为0.05%的吐温-80， 该发酵状态下测得蛋白酶活为106.78 U/mL，提取并测得黄酮、多酚、多糖含量分别为13.94、1.2、6.26 mg/g。试验结果显示，发酵后物质含量有所下降，但是相差不大。而且发酵后的饲料适口性更好， 有利于促进动物生长发育。