碱法提取茶酒糟中茶蛋白及其抗氧化抑菌研究

叶有明， 廖政达 ， 韦佳汝， 韦 华， 唐玉梅

（1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西 来宾 546199；2.广西三江县吉龙农业科技开发责任有限公司，广西 柳州 545500）

茶酒是以茶叶、 蔗糖和水为主要原料酿制而成的具有保健功能的酒（周丹丹等，2010），既具有茶的清香还具有抗氧化、抗菌消炎等作用（胡桂萍等，2016）。研究发现，茶酒酿造的副产物茶酒糟中仍然含有茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶蛋白等较多的营养成分（罗发美等，2020）。茶蛋白是一种天然的植物蛋白，主要存在于植物细胞中（王威威等，2022）。 在茶蛋白中非水溶性蛋白约为80%，其中含有80%谷蛋白、13%醇溶性蛋白质和少量球蛋白、白蛋白（陆晨，2012）。由于茶蛋白具有溶解性、起泡性、乳化性等较好的理化性质以及抑菌性、抗氧化性等生理活性，可有效地抑制腐败菌活性（王洪新等，2005），因此可作为天然的饲粮添加剂，在禽畜饲养中广泛应用。

目前， 非水溶性蛋白质提取的方式主要有酶法、复合法和碱液浸提法（金红等，2017；李永富等，2015；罗红玉等，2010）。 其中利用碱液浸提茶酒糟中的蛋白质是最传统的方法， 碱性溶液对茶酒糟中蛋白质的氢键具有破坏作用， 其可使蛋白质的溶解性增加（谭晓妍等，2018），提高提取时蛋白质的溶出。 酶法提取蛋白质，条件比较温和，能够使得与蛋白质相连的物质水解， 提高蛋白质的提取率（李圆圆等，2013）。 复合法采用微波、超声波、酶法等结合提取茶渣中蛋白质，极大增加了蛋白质提取率（陈仕学等，2015）。本文以蒸馏茶酒酒糟为原料， 采用恒温水浴振荡辅助碱法提取茶酒糟中蛋白质， 并对提取得到的茶蛋白进行抗氧化和抑菌性能研究， 为茶蛋白作为饲料在禽畜饲养中应用提供依据。

1 试验材料及仪器

1.1 材料与试剂 茶酒糟：广西三江吉龙农业科技有限公司。菌种：大肠杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，学院保藏菌种。 氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、甲醛、乙酰丙酮、硫酸铵、30%过氧化氢、硫酸亚铁、硫酸钾、硫酸、95%乙醇：西陇科学股份有限公司；水杨酸、对硝基苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯基：合肥巴斯夫生物科技有限公司，所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 电热恒温鼓风干燥箱：鹤壁市华泰仪器仪表有限公司，粉碎机：永康市红太阳机电有限公司，水浴恒温振荡器：杭州旌斐仪器科技有限公司，可见分光光度计：北京北分瑞利分析仪器有限公司，旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器生产厂，台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，电热恒温真空干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司，电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司，傅里叶红外光谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司。

2 试验方法

2.1 茶酒糟中蛋白质的提取工艺流程 茶酒糟→烘干→粉碎→过筛（100 目）→热水浸提→过滤去除上清液→茶酒糟水浴振荡碱液提取→6000（r/min） 离心10 min→收集上清液→消化→测定吸光度值。

2.2 茶蛋白质的测定 茶蛋白质参照《GB5009.5-2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（2017）进行测定。吸取试样溶液和试剂空白溶液各2 mL 于25 mL 的具塞比色管中， 分别加入4 mL显色剂和4 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液，混匀。 在100 ℃恒温水浴中反应15 min， 将比色管取出冷却后，置于1 cm 比色皿中，在最大吸收波长400 nm处测定其吸光度值， 利用所测得的氨氮标准曲线的回归方程，计算得到的提取液中氮的含量，按下式计算茶酒糟中蛋白质的提取量。

式中：C 为提取液中氮的含量，μg；m 提取液的质量，g；V1为提取液体积，mL；V2消化液体积，mL；V3为试样溶液总体积，mL；V4试样溶液体积，mL；1000 为换算系数；6.25 为转换系数。

2.3 茶蛋白质提取的单因素试验

2.3.1 料液比对茶蛋白质提取量的影响 称取1 g茶酒糟粉末分别置于5 个干燥的锥形瓶中， 固定NaOH 溶液的浓度为0.3 mol/L， 料液比为1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（g/mL），在50 ℃恒温水浴中振荡10 min，提取茶蛋白质，研究料液比对茶蛋白质提取量的影响。

2.3.2 浸提时间对茶蛋白质提取量的影响 称取1 g 茶酒糟粉末分别置于5 个干燥的锥形瓶中，固定料液比为1：25（g/mL），NaOH 溶液浓度为0.3 mol/L，在50 ℃恒温水浴中分别振荡6、8、10、12 min 和14 min，提取茶酒糟中蛋白质，研究浸提时间对茶蛋白质提取量的影响。

2.3.3 浸提温度对茶蛋白质提取量的影响 称取1 g 茶酒糟粉末分别置于5 个干燥的锥形瓶中，料液比为1：25（g/mL），碱液浓度0.3 mol/L，在温度分别为30、40、50、60 ℃和70 ℃的恒温水浴中振荡12 min，提取茶酒糟中蛋白质，研究浸提温度对提取茶蛋白质的影响。

2.3.4 碱液浓度对茶蛋白质提取量的影响 称取1 g 茶酒糟粉末分别置于5 个干燥的锥形瓶中，固定料液比1：25（g/mL），按照NaOH 溶液浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 和0.5 mol/L，在60 ℃的恒温水浴中振荡12 min， 提取茶酒糟中蛋白质，研究碱液浓度对茶蛋白质提取量的影响。

2.4 响应面法优化试验 根据从茶酒糟中提取蛋白质的单因素试验结果，以料液比、浸提温度、浸提时间和碱液浓度四个因素为响应面试验设计中的因素， 以茶酒糟中蛋白质提取量为响应值进行工艺条件优化。 采用Design-Expert8.0.6 软件，设计Box-Behnken 的中心组合试验方案，本试验选取四因素三水平设计试验， 响应面安排表如表1 所示。

表1 响应面试验设计

2.5 红外光谱检测

2.5.1 茶蛋白质样品的制备 将茶蛋白提取液浓缩后，置于电热恒温真空干燥箱24 h，将其烘干研磨，保存备用。

2.5.2 红外光谱检测方法 参照李圆圆（2013）的方法对茶蛋白进行红外表征，观察其特征基团。

2.6 茶酒糟中蛋白质抗氧化活性测定

2.6.1 茶酒糟中蛋白质提取液的制备 把最佳条件下制备得到提取液，在60 ℃的旋转蒸发器中浓缩至原来体积的1/2 后， 置于4 ℃的冰箱中保存备用。

2.6.2 羟自由基清除率测定 参照谢雨寻等（2022）的方法，按下式计算茶蛋白对羟自由基的清除率：

式中：Ao为空白组对照；Ai为样品组的吸光度；Aj为样品本底的吸光度。

2.6.3 DPPH 自由基清除率测定 参照参照谢雨寻等（2022）的方法，按下式计算茶蛋白对DPPH·的清除率：

式中：Ao为空白组对照；Ax为样品组的吸光度；Ay为样品本底的吸光度。

2.7 抑菌试验 抑菌试验主要参照苏巧玲等（2022）的方法并作修改。选取大肠杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3 种菌种作为试验材料，采用牛津杯法测试茶蛋白的抑菌活性， 采用汤强等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培养基。

茶蛋白提取液经浓缩，烘干。准确称取一定量的茶蛋白粗提物， 使用50 mL 的无菌水溶解，采用连续稀释法，配制成8 组不同浓度（0、0.1559、0.3117、0.6233、1.2467、2.4934、4.9867、9.9734 mg/mL）溶液，紫外灯下灭菌30 min。

取直径为6 mm 的滤纸片， 放到不同浓度的茶蛋白溶液浸泡2 h， 贴于牛肉膏蛋白胨培养基平板中，使其充分扩散后，放入培养箱，在37 ℃培养24 h，用无菌水浸湿的滤纸片作空白，测量各抑菌圈直径（赵建英等，2022）。 每个菌种分别在不同的茶蛋白浓度条件下做平行试验3 个，结果取平均值。

3 结果与分析

3.1 茶蛋白质提取的单因素试验结果

3.1.1 料液比对茶蛋白质提取量的影响 由图1可知，在料液比为1：15 ～1：35（g/mL）时，茶蛋白质的提取量随NaOH 溶液体积的增大而增加，料液比1：25 （g/mL) 时蛋白质提取量达到最大为17.93（mg/g）。 料液比在1：25（g/mL）之后，由于茶酒糟中的蛋白质充分溶出， 蛋白质的提取量不会随之增多。因此，可以初步确定从茶酒糟中提取蛋白质的最佳料液比为1：25（g/mL）。

图1 料液比对茶酒糟中蛋白质提取量的影响

3.1.2 浸提时间对茶蛋白质提取量的影响 由图2 可知，浸提时间在6 ～12 min 时，随着浸提时间的不断延长，茶蛋白质的提取量增加明显，主要是由于浸提的是茶酒糟表面易溶出的谷蛋白和醇溶蛋白，在水浴振荡时间为12 min 时，蛋白质提取量达最大值18.60 mg/g。 当时间过长时，部分蛋白在溶液中长时间受热发生水解（梁杰等，2020），导致提取率下降。 因此，可以初步选择12 min 为蛋白质提取的最佳浸提时间。

图2 浸提时间对茶酒糟中蛋白质提取量的影响

3.1.3 浸提温度对茶蛋白质提取量的影响 由图3 可知， 水浴振荡浸提茶蛋白质的温度在30 ～60 ℃时，随着水浴振荡温度的不断上升，茶酒糟中蛋白质的提取量也不断增加。 在浸提温度为60 ℃时，蛋白质提取量最大可达19.10 mg/g，温度过高提取率会下降， 原因是温度过高蛋白质会变性（梁杰等，2020），所以温度升高，将不利于蛋白质的提取。 因此，可以初步确定60 ℃为茶酒糟中蛋白质提取的最佳浸提温度。

图3 浸提温度对茶酒糟中蛋白质提取量的影响

3.1.4 碱液浓度对茶酒糟中蛋白质提取量的影响由图4 可知， 在NaOH 溶液浓度为0.1 ～0.3 mol/L时， 茶酒糟中蛋白质提取量随NaOH 溶液浓度的增大而增加，在碱液浓度为0.3 mol/L 时，蛋白质提取量达最大值19.4 mg/g。 由于在较高浓度碱液的情况下，蛋白质易变性和水解，造成蛋白质分子之间肽键的断裂， 导致提取液中的非蛋白物质增多（林彬彬等，2018）。从而导致茶酒糟中蛋白质提取量减少。 因此，选择NaOH 溶液浓度0.3 mol/L为最佳碱液浓度。

图4 碱液浓度对茶酒糟中蛋白质提取量的影响

3.2 茶酒糟中蛋白质提取的工艺优化

3.2.1 响应面法优化试验 使用Design-Expert8.0.6 软件对表2 中的数据进行分析， 建立二次回归方程，得到自变量料液比（A）、浸提时间（B）、浸提温度（C）和碱液浓度（D）与响应值茶酒糟中蛋白质提取量之间的二次多项回归方程：Y=-45.06+7.32A+11.92B+9.73C+124.93D-8.15×10-3AB-2.85×10-3+0.98AD+5.09×10-3BC-1.83BD+1.53CD-0.15A2-0.48B2-0.08C2-366.33D2。

表2 响应面设计茶酒糟中蛋白质提取试验结果

对上述回归模型进行显著性检验， 其结果见表3 所示。 表3 为各变量对茶酒糟中蛋白质提取量的方差分析， 从表中可看出模型P＜0.001，即此模型为极显著， 失拟项P =0.0581＞0.05 为不显著，说明该模型预测与实际试验相符，可用于茶酒糟中蛋白质的提取。 在响应面中复合相关系数R2=0.9581，R2Adj=0.9036， 表明该设计模型与试验的拟合程度良好。 各变量的F 值能反映出对茶酒糟中蛋白质的提取量的影响强度，F 值越大对提取量的影响越大， 各变量对蛋白质提取量的显著性顺序为浸提温度＞料液比＞浸提时间＞碱液浓度， 因此可知浸提温度直接影响蛋白质提取量的大小，而料液比、浸提时间和碱液浓度对蛋白质提取量的影响较小。

表3 茶酒糟中蛋白质提取量响应面回归方程的方差分析

3.2.2 响应面图形分析 依据响应面图形分析的原则，判断各因素间交互作用的显著性，需结合图形和方差分析表的结果综合判断。由图5 可知，图中（a）为料液比和浸提时间的交互作用，由图可知料液比和浸提时间的曲线平缓，在设定的范围内，其结果变化幅度不大， 说明这两个因素对蛋白质的提取量影响较小。图中（b）为料液比和浸提温度的交互作用， 由图可知料液比对提取量的影响不显著，而浸提温度的坡面比较陡峭，有明显的上升和降低的趋势， 说明浸提温度对蛋白质提取量的影响较大， 与方差分析表中浸提温度对蛋白质提取量影响为显著的分析结果一致。 图（c）（d）（e）（f）与上述分析一致，表明浸提温度对蛋白质提取量影响显著，而料液比、浸提时间和碱液浓度对蛋白质提取量的影响不显著。

图5 各因素交互作用

3.2.3 验证试验 通过软件分析， 可得从茶酒糟中提取蛋白质的最佳试验条件为料液比为1：25 g/mL，碱液浓度0.3 mol/L，在60 ℃恒温水浴振荡器中振荡12 min。 应用最佳试验条件，进行3 组平行试验检测提取液中蛋白含量， 得到蛋白质提取量平均值为24.62 mg/g， 与预测最优模型结果24.12 mg/g 相近，证明此试验方法重复性好，适用于茶酒中蛋白质的提取。

3.3 红外光谱检测结果 由图6 可知， 在3413 cm-1处有强吸收峰， 为O-H 伸缩振动峰；2939 cm-1处有弱吸收峰，为C-H 拉伸引起；2312、2126 cm-1和1410 cm-1均为蛋白质肽键或氨基中的NH 键形成的吸收峰，其中2312 cm-1处为蛋白中亚甲基和次甲基弯曲振动的二倍频区，2126 cm-1处为蛋白或氨基中N-H 键伸缩振动或弯曲振动的倍频区和合频区，1410 cm-1处为肽键和氨基中N-H 键伸缩振动一倍频区。 所以可以推断出该样品中有N-H 键和肽键等基团，该样品与蛋白质中主要基团一致。

图6 茶酒糟中蛋白质红外光谱图

3.4 茶蛋白质抗氧化试验

3.4.1 茶蛋白质对羟自由基清除效果 由图7 可知，蛋白质浓度为1 ～5 mg/mL 时，其对羟自由基的清除效果逐渐增强，最高时清除率可达26.6%。

图7 茶酒糟中蛋白质对羟自由基清除效果

3.4.2 茶酒糟中蛋白质对DPPH·清除效果 由图8 可知， 蛋白质浓度为1 ～5 mg/mL 时， 其对DPPH·的清除效果逐渐增强， 最高时清除率为34.0%。

图8 茶酒糟中蛋白质对DPPH·清除效果

考虑到提取液本身色素影响，由于颜色较深不便于测定吸光度值， 所以未继续测定在5 mg/mL之后浓度的提取液对羟自由基的清除效果， 但从茶蛋白质对羟自由基和DPPH·的清除效果来看，茶蛋白质具有一定抗氧化活性。

3.5 抑菌试验结果 由表4 可知，茶蛋白对不同菌种具有较强的抑菌能力， 因为除了茶蛋白具有一定的抑菌能力外， 茶酒糟提取得到的蛋白质中含有茶多酚， 茶多酚也具有抑菌能力 （魏汉等，2022）。茶蛋白对不同菌种的抑菌效果与菌种的类型和提取液浓度有关， 对不同菌种的抑菌能力大小依次为大肠杆菌＞表皮葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌。 茶蛋白提取液对三种供试菌的最小抑制浓度分别为0.3117、0.6223、1.2467 mg/mL，其对细菌的抑制作用随浓度的增大而增强。

表4 抑菌试验结果

4 结论

本试验结果表明：（1）通过单因素试验和响应面法优化，得到最佳提取工艺：NaOH 溶液浓度为0.3 mol/L，料液比为1：25（g/mL），60 ℃的水浴中振荡12 min，在此条件下茶酒糟中蛋白质的最大提取量为24.62 mg/g。 （2）对茶酒糟中提取的蛋白质粗制品扫描红外光谱， 可以推断出该样品中有N-H 键和肽键等基团，该样品与蛋白质中主要基团一致。（3）将从茶酒糟中提取出来的蛋白质进行抗氧化试验，当茶蛋白提取液浓度为5 mg/mL 时，其对DPPH·和羟自由基清除率分别为34.0%和26.6%，表明茶蛋白具有一定的抗氧化性。 （4）抑菌试验发现，茶蛋白对大肠杆菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都有抑制作用， 抑菌效果与菌种的类型和提取液浓度有关， 抑制作用随浓度的增大而增强。