超声法与闪式提取法提取栀子中栀子苷的工艺对比研究

崔 悦， 周新新，2， 汤鑫淼，2， 李乐乐， 林晓影， 冯 波， 关 皎*， 朱鹤云*

（1.吉林医药学院药学院，吉林吉林 132013；2.延边大学药学院，吉林延吉 133002）

栀子又称黄栀子、山栀，为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，能够泻火除烦、凉血解毒、清热利湿。我国中部和南部地区为其主要产地（阿润等，2021；赵梦亭等，2021）。栀子中的主要化学成分为环烯醚萜苷类化合物，其中以栀子苷含量最高。近几年，由于栀子具有无副作用和绿色环保等显著优势，栀子及其副产品被广泛应用于饲料添加剂，其不仅可以降低畜禽抗生素类物质摄入量，还可以有效减少其血糖及胆固醇含量，从而最大化提高畜禽副产品的品质，同时也为人类食品健康与安全提供有效保障（成祖斌等，2021）。

目前，栀子苷的提取方法主要包括：超声法（欧阳薇等，2016；黄弦等，2013；吴亚超等，2011）、回流提取法等（康艳萍等，2018）。文献中鲜见多种方法提取栀子苷的比较性研究。闪式提取法可将药材与提取溶剂快速机械混合以在短时间内将溶剂渗透到药材组织中实现快速的提取（李丽等，2020；刘建新等，2016；武艳梅等，2011）。本文以栀子苷的提取率作为评价指标，采用不同的因素和水平进行正交试验。通过正交试验分别筛选出超声法和闪式提取法的最佳提取工艺并进行验证，并比较两种方法经最佳提取工艺得到的栀子苷的提取率，确定栀子中栀子苷的最佳提取工艺，为栀子在饲料领域的应用以及后续的开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-500GVDV型三频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JHBE-50S型闪式提取器（河南金鼐科技发展有限公司）。栀子药材购自吉林省吉林市，经吉林医药学院鉴定为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoidesEllis.）的干燥成熟果实，栀子苷对照品（纯度＞98%，批号：19101705），购自成都普菲德生物技术有限公司。

1.2 栀子苷含量测定方法学考察

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Shim-pack GIST柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，SHIMADZU），预柱为C18保护柱（4.0 mm×10 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸水-乙腈（85:15，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为238 nm，柱温为35℃；进样量为10 μL。栀子苷对照品与栀子样品的色谱图见图1。

图1 栀子苷（A）和栀子样品（B）HPLC色谱图

1.2.2 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，以甲醇作为溶剂配制成1 mg/mL的对照品储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取栀子药材粉末0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，称定重量，超声功率为150 W，提取0.75 h，待至室温后再次称重，并将减失的重量用50%乙醇补足，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，临用前用流动相稀释20倍作为超声法的供试品溶液。

1.2.4 标准曲线的制备 取对照品储备液，精密吸取适量，以甲醇为溶剂配制成栀子苷系列对照品溶液5、10、20、50、100、200 μg/mL，进样分析，以峰面积为纵坐标（Y），栀子苷溶液浓度为横坐标（X），进行线性回归计算。

1.2.5 精密度试验 以浓度为50 μg/mL的栀子苷对照品溶液作为待测样品，按照上述色谱条件进样6次，计算峰面积的RSD值。精密度试验得RSD为1.4%，即方法精密度符合要求。

1.2.6 稳定性试验 取栀子药材适量，制备得到栀子样品溶液，分别于室温放置0、4、8、12、24 h后进样分析并计算RSD值。稳定性试验RSD为1.3%，即样品稳定性符合要求。

1.2.7 重复性试验 取同一批栀子样品共6份，制得供试品溶液并分析，计算RSD。重复性试验RSD为0.7%，即方法重复性符合要求。

1.2.8 准确度试验 取已知栀子苷含量的栀子药材适量，分别加入相当于栀子苷含量80%、100%、120%的对照品溶液，进样分析，并计算其回收率和RSD。准确度试验栀子苷的平均回收率为98.1%（RSD=1.3%），即方法准确度符合要求。

1.2.9 含量测定 取供试品溶液，采用HPLC方法测定，各样品平行操作3次，代入标准曲线计算栀子苷含量。

1.3 栀子苷提取工艺的单因素考察 分别设置乙醇浓度10%、30%、50%、70%、90%，超声法的提取时间为0.25、0.5、0.75、1、1.25 h；闪式提取法的提取时间分别为1、2、3、4、5 min，料液比分别为1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL和超声法选取的功率分别为50、100、150、200、250 W为考察因素和水平，筛选出影响栀子饲料添加剂提取的较优水平。

1.3.1 超声法提取栀子中的栀子苷 以乙醇浓度（A）、时间（B）、功率（C）和料液比（D）为4个考察因素，各因素包括3个水平，采用L9（34）设计试验，各因素水平见表1。

表1 超声法因素水平

1.3.2 闪式提取法提取栀子中的栀子苷 以乙醇浓度（A）、料液比（B）和时间（C）3个因素，采用L9（34）设计正交试验，各因素水平见表2。

表2 闪式提取法因素水平

1.3.3 超声法与闪式提取法提取效果对比 以各方法最佳工艺提取栀子苷并进行对比。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 分别以峰面积为纵坐标（Y），栀子苷溶液浓度为横坐标（X），进行线性回归计算。经线性回归计算得Y=1.598×104X-1.048×104（r=0.9998）。结果表明，栀子苷在浓度为5～200 μg/mL时线性关系良好。

2.2 单因素考察结果

2.2.1 乙醇浓度 超声法和闪式提取法中考察不同乙醇浓度对栀子苷提取率的影响，选取的乙醇浓度分别为10%、30%、50%、70%、90%，料液比均为1:50（g/mL）。其中，超声法试验中超声时间0.75 h，超声功率为150 W；闪式提取法试验中，提取时间3 min。将提取后得到的供试品溶液进样分析，测定样品中栀子苷的含量。由图2（A）、图3（A）知，无论是超声法还是闪式提取法栀子苷的提取率都随乙醇浓度升高而升高，当升高至70%后提取率开始下降，故70%乙醇为最佳提取溶剂。

2.2.2 提取时间 超声法和闪式提取法中考察不同提取时间对栀子苷提取率的影响，其中超声法的提取时间分别为0.25、0.5、0.75、1、1.25 h，超声功率为150 W；闪式提取法的提取时间分别为1、2、3、4、5 min；两种方法均采用50%乙醇作为提取溶剂，料液比均为1:50 g/mL。将提取后的供试品溶液进样分析，测定样品中栀子苷的含量。由图2（B）、图3（B）知，无论是超声法还是闪式提取法栀子苷的提取率都随提取时间的增加而升高，当达到一定时间后最后趋于稳定。其中，超声法的最佳提取时间为0.75 h，闪式提取法的最佳提取时间为3 min。

2.2.3 料液比 超声法和闪式提取法中考察不同料液比对栀子苷提取率的影响，选取的料液比分别为1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL。其中超声法的提取时间为0.75 h，超声功率为150 W；闪式提取法的提取时间为3 min；两种方法均采用50%乙醇作为提取溶剂。将提取后的供试品溶液进样分析，测定样品中栀子苷的含量。由图2（C）、图3（C）知，无论是超声法还是闪式提取法栀子苷的提取率都随提取料液比的增加而升高，当料液比达到1:60 g/mL后，提取率基本保持不变。故超声法和闪式提取法的最佳提取料液比均为1:60 g/mL。

图3 闪式提取法单因素试验结果

2.2.4 功率 超声法中超声功率也会对栀子苷的提取率有一定影响，故也应该对超声功率进行单因素考察。选取的功率分别为50、100、150、200、250 W。以50%乙醇作为提取溶剂，提取时间为0.75 h，料液比为1:50 g/mL。将提取后的供试品溶液进样分析，测定样品中栀子苷的含量。由图2（D）知，栀子苷的提取率随超声功率的增加而升高，超声法的最佳提取功率为250 W。

图2 超声法单因素试验结果

2.3 正交试验结果

2.3.1 超声法提取栀子中的栀子苷 以栀子苷提取率（%）为考察指标，并取样品3份对最佳工艺进行验证。正交试验和方差分析结果分别见表3、表4。

表3 超声法正交试验结果

表4 超声法方差分析结果

由表4可知，各因素对栀子苷提取率的影响顺序为C＞D＞B＞A，各因素对提取工艺无显著性影响。超声法最佳工艺为A3B3C2D1，即70%乙醇，提取1 h，功率200 W，料液比1:40。取供试品3份，按此工艺验证，栀子苷平均提取率为6.90%，表明此为超声法最佳工艺。

2.3.2 闪式提取法提取栀子中的栀子苷 以栀子苷提取率（%）为考察指标，并取样品3份对最佳工艺进行验证。各因素水平、正交试验和方差分析结果分别见表5、表6。

表5 闪式提取法正交试验结果

表6 闪式提取法方差分析结果

由表6可知，各因素对栀子苷提取率影响顺序为A＞B＞C，各因素对试验结果均无显著性影响。闪式提取法的最佳方案为A1B2C3，即30%的乙醇，料液比1:50，提取3 min。取供试品3份，按此工艺验证，栀子苷平均提取率为6.21%，高于正交试验的最高提取率（5.78%），表明此工艺为闪式提取法最佳工艺。

2.4 超声法与闪式提取法提取效果对比 由表7可知，超声法提取率略高于闪式提取法，但其时间为闪式提取法的20倍，且闪式提取法乙醇浓度相对较低，综合料液比等因素，其更加环境友好、省时高效。

表7 不同方法提取栀子苷的提取率

3 结论

由超声法和闪式提取法提取栀子中栀子苷的单因素试验和正交试验结果可知，超声法的最佳提取工艺为70%乙醇，提取1 h，功率200 W，料液比1:40，提取率为6.90%；闪式提取法最佳提取工艺为30%乙醇，料液比1:50，提取3 min，提取率为6.21%。超声法提取率略高于闪式提取法，但综合考虑乙醇浓度、料液比、提取时间等多种因素，闪式提取法更省时节能，适于对栀子中栀子苷的现代化提取，可为栀子在饲料领域的应用及开发提供一定参考。