激素和抑制剂对乳腺组织形态和乳蛋白合成的影响

时间：2024-05-23

田青，王海平，黄和升，梁天林，李萌

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003；2.江苏大川生物科技有限公司，江苏淮安223003）

研究发现INS、PRL和HYD等激素可以调节乳蛋白的合成（Pauloin等，2012；Xudong等，2011；Burgos等，2010）。本实验室前期研究结果也表明，INS、PRL和HYD单独或联合作用都能增加奶牛乳腺上皮细胞的增殖和促进乳蛋白的合成（田青等，2014、2013），并且田青等（2016、2015）还证明这种调节作用主要是通过mTOR和JAKSTAT信号通路发挥的。Qian（2009）和Burgos（2010）提出AG-490是一种对JAK2激酶选择性抑制的抑制剂，能够阻止JAK2-STAT5A信号通路作用的发挥。Pauloin等（2012）提出LY294002是一种PI3K激酶选择性抑制剂，能够抑制mTOR信号通路作用的发挥。为了确定前期研究结果在体内和体外是否一致，本试验选用泌乳期Wistar大鼠作为试验动物，分别选用LY294002和AG-490来抑制mTOR和JAK-STAT信号通路，然后通过对新生仔鼠的平均日增重、泌乳大鼠平均产奶量、大鼠乳腺上皮细胞形态学变化、血浆和乳腺组织中激素和蛋白基因的表达等指标的测定来进行验证。

1 材料与方法

1.1 试验动物从扬州大学比较医学研究中心购买平均体重为（200±20）g的Wistar大鼠，采用12 h光照，12 h黑暗的交替光照控制法，在相对温度15～20℃，相对湿度50%～70%的条件下饲养，全程自由饮水，自由采食。

1.2 试验处理经过3 d的产后修复，母鼠连同出生仔鼠以窝为单位随机分为4个组，每组6个重复，每个重复6窝，每窝一只母鼠，6只仔鼠。从第4天开始，对照组母鼠每隔1天定时（早晨8：00）肌肉注射生理盐水2 mL，试验组母鼠每隔1天定时（早晨8：00）分别按照表1的设计方案肌肉注射2 mL，试验期14 d。每天记录大鼠的泌乳量和仔鼠日增重。

表1 试验设计

1.3 大鼠平均泌乳量的测定参照Silberstein（1987）的方法进行，即以窝为单位，每天早晨8：00将仔鼠与母鼠分开，4 h后以窝为单位称重仔鼠，之后立刻放回到母鼠身边开始哺乳，60 min后再次以窝为单位称重仔鼠（在此期间仔鼠禁食禁水），两次称重的体重差即大鼠平均泌乳量。

1.4 仔鼠平均日增重的测定试验期末仔鼠窝平均体重与试验始仔鼠窝平均体重的差除以试验期天数（14）即得仔鼠平均日增重。

ADG/g=[试验期末仔鼠窝平均体重（g）-试验始仔鼠窝平均体重（g）]/14。

1.5 血浆和组织样的收集与准备最后1次泌乳量测定完成后，母鼠用10%水合氯醛以10 mL/kg体重的剂量腹腔注射麻醉，之后心脏采血5 mL，4000 r/min离心15 min，收集血浆，分装后-20℃保存。采血后，立即采集右侧靠近尾部的三对乳腺组织，液氮保存，用于测定组织蛋白含量。收集左侧腹股沟处最大的乳腺组织，10%的中性甲醛固定，用于大鼠乳腺组织形态学测定。

1.6 大鼠乳腺组织切片的制备固定：无菌采取乳腺组织样本后立即转移至含有5 mL 10%中性甲醛无菌试管固定24 h，然后将组织转移至另外一只含有5 mL 10%中性甲醛的试管中保存。

脱水：固定后的组织分别在70%、80%和90%的酒精中连续脱水3 h。

透明：脱水后的组织先转移至二甲苯溶液中20 min，然后用新鲜的二甲苯溶液重复孵育20 min。

透蜡：二甲苯处理后的组织转移至65℃溶解石蜡中包埋40 min，然后重复此操作1次。

包埋：将浸蜡后的组织转移至溶解的石蜡磨具中，使之迅速凝固成蜡块。

切片：用显微镜薄片切片机将石蜡包埋的组织切成3～4 μm的薄片，将薄片放入温水（40 ℃）中展开并小心转移至载玻片上，自然晾干。

染色：将干燥的切片放入二甲苯溶液中5～10 min，如此再重复一次，溶去切片上的石蜡，随后将切片依次放入无水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min后即可按照苏木精和HE染色试剂的说明书进行染色。切片先用苏木精染液染色5～10 min，进入自来水10 min，随后用蒸馏水洗去残留的染液。接着用95%乙醇润洗5 s，伊红染色0.5～2 min，70%乙醇润洗后用95%乙醇脱色2次，每次2 min。随后，二甲苯清洗2次，每次5 min。最后，用中性橡胶密封切片，用显微镜观察。蓝色为细胞核，粉红色或红色为胞质。

1.7 大鼠乳腺组织和血浆中酪蛋白和激素含量的测定用上海碧云天公司增强型BCA蛋白测定试剂盒，根据其说明书对液氮中保存的大鼠乳腺组织进行处理，总蛋白、总酪蛋白和κ-酪蛋白的含量用上海悦颜生物有限公司大鼠总蛋白、总酪蛋白和κ-酪蛋白ELISA试剂盒进行测定。INS、PRL和HYD水平也用上海悦颜生物有限公司的ELISA试剂盒进行测定。

1.8 数据统计与分析采用SAS 9.1软件中单因素方差分析和Tukey法进行多重比较。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源激素和抑制剂对泌乳期大鼠乳腺组织形态的影响与对照组相比，PRL、HYD和INS三种激素联合作用组细胞呈典型的圆形和椭圆形，细胞大小均匀，乳导管分布明显，说明三种激素联合作用对泌乳期大鼠乳腺上皮细胞的形态无显著影响，但是细胞信号通路抑制剂LY294002和AG-490添加组细胞形态不完整，乳导管分布也不规则，推测可能是抑制剂对正常细胞的形态损伤造成的。

2.2 外源激素和抑制剂对泌乳期大鼠平均泌乳量和新生仔鼠平均日增重的影响由表2可见，与对照组相比，激素组合与两种抑制剂对泌乳期大鼠平均泌乳量和平均日增重的影响差异不显著（P＞0.05）。但是，在各试验组之间，8 d和14 d时试验3组母鼠的平均泌乳量比试验1组分别增加20.75%和7.04%，比试验2组分别增加了 13.65%和 8.84%（P ＜ 0.05）；10 d时，试验3组仔鼠平均日增重较试验2组降低了45.81%（P ＜ 0.05）。

2.3 外源激素和抑制剂对泌乳期大鼠血浆总蛋白和激素水平的影响由图1可见，与对照组相比，激素组合与两种抑制剂对泌乳期大鼠血浆总蛋白含量的影响差异不显著（P＞0.05），但各试验组血浆总蛋白水平均低于对照组。

表2 新生仔鼠平均日增重和泌乳大鼠平均泌乳量分析

由图2～图4可见，与对照组相比，试验1、2、3组血浆INS水平分别降低3%、4.98%和4.12%，试验 1、2、3组血浆 HYD水平分别降低 3.07%、5.04%和4.17%，而试验1、2、3组血浆PRL水平分别降低3.75%、4.66%和4.45%（P＜0.05）。各试验组之间，血浆催乳素水平差异不显著（P＞0.05）。

2.4 外源激素和抑制剂对泌乳期大鼠乳腺组织酪蛋白含量的影响由图5可见，与对照组相比，试验1、2、3组对大鼠乳腺组织中总蛋白含量的影响差异不显著（P=0.071），但在各试验组之间，试验2、3组大鼠乳腺组织中总蛋白含量低于试验1组，降低了20.79%和30.94% （P＜0.05）。

由图6和图7可见，与对照组相比，不管是激素的复合作用还是抑制剂，均显著降低了大鼠乳腺组织中k-酪蛋白和总酪蛋白的含量，其中试验1、2、3组组织中k-酪蛋白的含量与对照组相比分别降低了4.06%、3.28%和3.01%，组织中总酪蛋白含量与对照相比分别降低了4.48%、3.47%和3.07%（P＜0.05），但各试验组之间差异均不显著（P＞0.05）。

2.5 外源激素和抑制剂对泌乳期大鼠乳腺组织激素水平的影响由图8～图10可见，与对照组相比，不管激素复合作用还是抑制剂，均对大鼠乳腺组织中催乳素水平无显著影响（P＞0.05），但均显著降低了乳腺组织中胰岛素的水平，试验1、2、3组与对照组相比分别降低了11.62%、11.26%和6.41%（P ＜ 0.05），对氢化可的松而言，AG-490抑制剂显著增加了乳腺组织中HYD水平，与对照组相比增加了2.69%（P＜0.05），其他各组间差异不显著（P ＞ 0.05）。

3 讨论

3.1 外源激素和抑制剂抑制了大鼠乳腺组织中乳蛋白的合成试验研究结果表明，外源激素和抑制剂对大鼠血浆总蛋白含量无影响，却显著降低了血浆激素含量。在乳腺组织中，除外源激素的联合作用对乳腺总蛋白含量略有上升外，外源激素和抑制剂均显著降低了大鼠乳腺组织中总酪蛋白和k-酪蛋白的含量，与Tian等（2015）研究结果看似不一样但却也不矛盾。其原因可能是，体外研究的环境较为单一，基本上是在无任何其他激素干扰而仅仅聚焦于待研究激素的情况下，而体内的情况更复杂，对于本试验所选择的健康泌乳期的大鼠，本身就具有相对平衡和强大调节功能的内源激素系统，在外源激素和抑制剂注射后反而会影响机体固有内分泌系统的平衡。因此，在机体固有内分泌系统的调节下，为了维持这种平衡会额外消耗蛋白合成的前体物、能量而造成原有内分泌系统的短暂紊乱，这就导致了血浆总蛋白、k-酪蛋白和组织蛋白含量的显著下降。

Tian 等（2016）研究结果表明，LY294002 可以诱发细胞凋亡，同时也会下调mTOR信号通路和JAK-STAT信号通路中相关基因和激素受体基因的表达，进而抑制CSN3基因的表达，这和本试验研究结果一致。本试验中血浆和乳腺组织中激素水平的变化情况也验证了蛋白质水平变化的结果和分析。本试验研究结果表明，外源激素和抑制剂均显著降低了泌乳期大鼠血浆中的激素水平，使乳腺的激素水平更加杂乱。与对照组相比，除AG-490显著增加了乳腺组织中氢化可的松水平外，外源激素和抑制剂对其他组催乳素和氢化可的松含量影响不大，但对胰岛素，外源激素和抑制剂依然显著降低了其在乳腺组织中的水平，这和蛋白质层面的试验结果正好呼应。因此，建议在动物疾病或机体代谢紊乱的情况下，可以通过注射外源性激素来调节内源性激素的平衡；而在健康动物的正常生理水平下，则无需外援干涉。

3.2 抑制剂显著破坏了大鼠乳腺组织结构乳腺是产乳和乳蛋白合成的主要场所。腺泡是乳腺的实质部分，是乳腺的功能单位，在乳蛋白的合成和分泌、乳汁的排出等过程中起作用，可将血液中的营养物质转化为乳汁。此外，Silberstein（1987）和Yang（2005）发现，乳腺间质具有保护和支持乳腺组织的功能，其发育和功能状态直接影响哺乳动物的产乳和产奶质量。在妊娠期和哺乳期，多种生长因子、激素和细胞外基质参与调节乳腺细胞的增殖、分化和泌乳。本试验结果表明，外源激素组细胞呈典型的圆形和椭圆形，细胞大小均匀，乳导管分布明显，说明其对泌乳期大鼠乳腺上皮细胞的形态无显著影响，但是LY294002和AG-490组细胞形态不完整，乳导管分布也不规则。结合泌乳大鼠血浆和乳腺组织的激素分泌情况，推测产生此结果的可能原因是抑制剂组是在额外添加外源激素的同时添加抑制剂，外源激素单独作用虽然造成了健康的泌乳期大鼠内分泌的紊乱，但还没有达到损伤乳腺组织的程度，而抑制剂组在造成了内分泌紊乱的同时，还造成转录水平或蛋白翻译水平的部分中断，致使乳腺组织结构受到损伤。 Brisken（1999）和 Clevenger（2003）等多项研究表明，哺乳动物的PRL可以通过自分泌和旁分泌信号调节乳腺发育，进而促进泌乳和维持泌乳。对于乳腺形态，Freeman（2000）和 BoleFeysot（1998）等研究表明，PRL不仅间接控制未孕小鼠的导管分支和终末芽的降解，还控制乳腺上皮细胞促进小叶腺泡的发育。这些结果也在一定程度上验证了上述结果，说明抑制剂破坏正常乳腺形态的作用是导致酪蛋白含量下降的另一个主要原因。此分析也可能从泌乳大鼠的泌乳量和新生仔鼠平均日增重的结果得到验证。本研究结果发现，在各试验组之间，LY294002显著增加了不同时期母鼠的平均泌乳量，却显著降低了试验末仔鼠的平均日增重，说明由于乳腺组织损伤、乳腺中蛋白质组成的改变导致乳品质的下降，进而造成了新生仔鼠平均日增重的显著降低。