饲料和食品中三聚氰胺毒性与其残留的检测探讨

张 昂

(濮阳职业技术学院,河南濮阳 457000)

近年来，三聚氰胺受到社会各界的广泛关注，尤其是三鹿等品牌的奶制品出现三聚氰胺问题，严重打击消费者对食品安全的信心。三聚氰胺是一种化工原料，对人体有很大危害。三聚氰胺的含氮量达到66%。而蛋白质的含氮量为16%，一些不法分子通过添加三聚氰胺造成食品或饲料的蛋白质含量虚高。动物三聚氰胺慢性毒性试验中，主要症状为膀胱癌、肾结石。三聚氰胺动物口服半数致死量为3100～3300 mg/kg。三聚氰胺主要以同系物或原体形式排出体外，在生物体内无代谢转化。

1 饲料和食品中三聚氰胺毒性

三聚氰胺是重要的尿素后加工产品，别名为蜜胺、三聚酰胺、氰尿酰胺，属于三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺微溶于水及乙醇。在弱酸性条件下，与羟甲基的衍生物反应，产生树脂产物。弱碱性或中性条件下，与甲醛生成羟甲基三聚氰胺。三聚氰胺不溶于四氯化碳、苯、醚，是纯白色单斜棱晶体，并且无味。在饲料和食品中添加少量三聚氰胺，蛋白含量会出现虚高（李香珍，2020）。因此，一些不法商人会在食品或饲料中添加三聚氰胺。三聚氰胺主要可以制作三聚氰胺树脂，用于制作装饰材料，也可以用于制造化肥、脱漆剂等。

国际化学品安全规划署在1994年发布的安全手册中说明，三聚氰胺长期或反复大量摄入可能影响膀胱和肾，产生结石。在动物药代动力实验中显示，三聚氰胺基本不能在体内代谢、转化，在动物肾脏中形成晶体，不通过肝脏代谢。高浓度三聚氰胺（超过1.667 mg/mL），增加三聚氰胺浓度，细胞存活率下降。在小鼠实验中，将20000 mg/kg三聚氰胺给小鼠，9 h后小鼠出现不安、呼吸急促反应，直到最终小鼠死亡。其他相对低剂量的小鼠出现厌食、精神不振等，也有的在48 h内死亡。解剖小鼠显示，在输尿管中存在蓄积大量晶体。部分肾脏被膜中存在晶体。在猫实验中，添加三聚氰胺作为日粮，晶体出现在猫的肾小管管腔中，并且肾脏淋巴细胞浸润，血清尿素氮上升（李桂萍，2018）。在生产过程中同时存在三聚氰胺、三聚氰酸两种相似的结构。三聚氰酸可以被反刍类动物消化，因此，在反刍动物饲料中广泛应用。三聚氰酸加三缩脲应用于添加剂，含量不能超过30%（刘韬等，2017）。三聚氰酸单独摄入不会造成很严重的后果。但如果同时存在三聚氰胺与三聚氰酸，会在在肾脏中再次作用，形成大分子不溶于水的复合物，逐渐沉积，导致结石（白静等，2020）。结石阻塞肾小管无法排出尿液，严重影响肾脏功能，最终导致肾脏衰竭。目前，对三聚氰酸、三聚氰胺在血液无法相互结合的原因尚不明确，可能是由于肾脏浓缩作用。通常产品含有三聚氰胺，也会含有三聚氰酸。

2 三聚氰胺残留的检测材料与方法

2.1 材料 原料：南美白对虾饲料，罗非鱼饲料。

主要试剂：庚烷磺酸钠，三聚氰胺标准品，Waters Oasis MCX（60 mg）固相萃取柱，柠檬酸，三氯乙酸，乙腈，浓盐酸，乙酸铅，二氯甲烷，甲醇，乙酸铅，氨水等。

主要仪器：光～紫外分光光度计，电子分析天平，数控固相萃取仪，超声波清洗器，超纯水机，高速冷冻离心机，氮吹仪，高效液相色谱仪，漩涡混匀器等。

2.2 试验方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：乙腈为流动相。5 μm DIKMA C18（250 mm×4.6 mm）。柱温40℃。0.45 μm滤膜过滤试样液、流动相。检测波长236 nm。离子对试剂溶液=8∶92（V/V）。进样量20 μL，流速为1.2 mL/min。

2.2.2 样品前处理 粉碎饲料样品，取2 g。放入离心管中。在离心管中加入19 mL提取液。然后加入1 mL乙酸铅溶液，摇匀。超声处理20 min，离心处理，经二氯甲烷萃取。在试管中放入上层液，加入纯水2 mL，再次萃取，与水溶液合并，使用3 mL水与甲醇预先活化。然后Waters Oasis MCX固相萃取柱。保持1 mL/min的速度过提取液。对于Waters Oasis MCX固相萃取柱，用淋洗液洗涤，氮吹仪吹干洗脱液，加入1 mL的20%甲醇溶液。使用0.45 μm滤膜过滤，完成后上机待测。

样品加标：l mL三聚氰胺标准溶液加入样品。室温放置0.5 h，取提取液18 mL，然后乙酸铅溶液1 mL加入其中，其他与样品处理一致。

2.2.3 溶液配制 标准储备液：取0.1 g三聚氰胺标准品超声溶解，应用甲醇水溶液定容100 mL。

流动相：取l L容量瓶，用柠檬酸2.1 g，庚烷磺酸钠2.02 g，水980 mL溶解。将pH调节到2.7，混匀，使用0.45 μm滤膜过滤。

标准工作液：使用100 mL容量瓶，放入1 mg/mL三聚氰胺标准溶液，定容至100 mL，使用甲醇水溶液。作为中间工作液，稀释为标准工作液10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL。

3 结果与分析

3.1 色谱条件选择试验

3.1.1 流动相比例 选择乙腈与缓冲液的流动相比例，10∶90，13∶87，15∶85，20∶80，三聚氰胺峰与杂质峰没有完全分开，分离度较差，保留时间太短。流动相比例7∶93，8∶92，具有良好的峰形与分离度。但对于流动相比例7∶93，分离出杂质，保留时间太长。流动相比例8∶92与试验要求相符合，因此流动相选取乙腈∶缓冲液=8∶92。

表1 三聚氰胺流动相pH试验

3.1.2 流动相pH 在pH 2.5～4的流动相酸度范围，离子对的pH越小，保留时间越短，干扰多，杂峰较多。反之亦然。三聚氰胺色谱的保留时间受离子对的影响（高丽婷，2020）。综合分析，pH=2.7的离子对最佳，峰形良好，并且三聚氰胺峰、杂质峰完全分离。

3.1.3 流动相流速 三聚氰胺流动相的分离效果受流速的影响。动相流速与色谱保留时间呈负相关，动相流速越高，保留时间越短（孙娅莉，2020）。杂质峰与三聚氰胺峰对流动相流速1、1.2 mL/min下均可完全分离，效果相似。本文使用1.2 mL/min的流动相流速。

3.2 优化样品前处理方法

3.2.1 洗脱液的回收率 由图3可知，洗脱液体积不断增加，回收率先增加到6～7 mL，后开始下降。洗脱体积选取6 mL相对最干净，并且回收率最高。

3.2.2 淋洗液选取 选取不同的淋洗液显示，甲醇和水具有良好的效果，分别3 mL的甲醇和水，回收率92.5%左右，并且相对稳定。分别3 mL的0.1 mol/mL Hcl与甲醇，回收率相对较低，为86.3%。

3.2.3 不同提取液的效果 选取不同的三聚氰胺提取溶液，如下表所示。每种进行三次平行提取，比较提取效果。结果显示，50%乙腈水的提取效果比较好，最好的是1 mol/LHCl+50% 乙腈水，提取效果稳定，结果最好。因此，使用乙腈水与HCl为提取溶液。

3.3 线性范围 选取20 μL进样量分别进样10、5、2、1、0.5、0.2 ug/mL的三聚氰胺标准工作液，应用高效液相色谱法进行检测。同时进行线性回归，线性关系在三聚氰胺浓度为0.2～5 μg/mL时峰面积良好。

表2 不同提取液提取试验结果

3.4 回收率及精密度 选取饲料样品15份，分成3组，每份饲料样品2 g。分别在每组饲料样品中加入10、2、1 mg/kg的三聚氰胺，每个样品测5次。相对标准偏差为2.11%～4.76%，回收率为89%～100%。

3.5 饲料样品的检测 检测A饲料公司和B饲料公司的南美白对虾饲料、罗非鱼饲料，检测样品的三聚氰胺含量如表3。大部分饲料样品的三聚氰胺含量符合国家标准，但罗非鱼饲料超过标准。

表3 饲料样品中三聚氰胺的检测结果

4 结论

本文优化高效液相色谱法的色谱条件和处理方法，选取最佳的方式检测饲料中的三聚氰胺残留。在检测中使用3 mL甲醇与3 mL水的淋洗液。采用5%氨水甲醇6 mL进行洗脱。使用20%甲醇水1 mL溶解。使用50%乙腈水及l mL lmolHCl作为提取液。15 mL二氯甲烷萃取，然后活化固相萃取柱。色谱条件设置为240 nm的波长，1.2 mL/min的流速，柱温40℃。流动相为8∶92的乙腈与缓冲液。检测饲料样品，显示存在超过国家限量标准的三聚氰胺含量。