HPLC-MS/MS快速测定饲料中25种喹诺酮类药物

严 明， 严 寒，唐 建， 吴 涛， 覃晓明， 潘芳菲， 兰 玉

（广西壮族自治区饲料监测所，广西南宁530001）

目前，喹诺酮类药物（QNs）已经生产4代药物，其中NAL为第一代QNs的代表，包括OXO、PRA等品种；第二代QNs以PPA、CIN为代表；第三代QNs以CIP、NOR、OFX等为典型代表；第四代QNs包括MOX、BAL、GAT等。这几代化合物结构中的萘啶环被进行了修饰，具有抗菌谱逐渐扩大、吸收快和生物利用度高等优点（Karl Drlica等，2009；郭少忠等，2008），因此在养殖业被广泛应用。然而QNs随食物链进入人体代谢蓄积，造成毒副作用（汪皓琦等，2017；高玮岐等，2017），并对生态环境造成破坏（Gullberg等，2011；Kümmerer等，2009）。近年来，QNs抗生素的耐药性问题也开始被重视。为此，自2005起，美国食品和药物管理局（FDA）禁止ENR使用（FDA，2005）；2015年农业部在规定停止经营和使用NOR、LOM、OFX、PFN 4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂（中华人民共和国农业部公告 第2292号，2017）；2019年农业农村部发布194号公告，规定自2020年7月1日起，停止所有促生长类药物饲料添加剂的生产，QNs正式在饲料中禁用（中华人民共和国农业部公告第194号，2020）。为了监控饲料中QNs的非法使用，需要建立饲料中抗生素的检测方法。

目前，国内外关于QNs检测方法有酶联免疫法（陈浩等，2020；李新朋等，2014；Scortichini等，2009）、高效液相色谱法（谭美英等，2012；Gbylik等，2012；惠芸华等，2010；Galarini等，2009；施杏芬等，2008）、高效液相色谱质谱法等（贾涛等，2019；柯庆青等，2019；候美玲等，2018；Samanidou等，2008；Rubies等，2007）。酶联免疫法仅使用于单类QNS的检测，需要较好的净化手段。液相色谱法对样品基质要求较高，检测限较高，无法满足痕量检测要求；近年应用LC-MS/MS进行QNs精确定量和确证方法研究日趋增多，然而大多数检测方法仅检测饲料中1～16种药物，缺乏对4代QNs药物的同步检测方法。为此，本实验旨在建立利用LC-MS/MS测定饲料中25种（表1），涵盖4代QNS药物的方法。

表1 25种QNs名称及化合物信息

1 材料与方法

1.1 仪器与材料Acquity UPLC-Xevo TQS（Waters，美国）：配有电喷雾离子源（ESI）；超声清洗器（西班牙，Fungilab）；自动涡旋混合器（QL-901Vortex，其林贝尔仪器制造有限公司，海门市）；台式离心机（德国，Sigma）；尼龙有机滤膜（0.22 μm，安谱实验科技股份有限公司，上海）；超纯水器（MILLIPORE，美国）；N-Evap nitrogen evaporator氮吹仪（Organomation Associates，美国）；各型号移液枪（Eppendorf，德国）；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）（Waters，美国）；甲酸（色谱纯级，Sigma）；乙腈和甲醇（色谱纯级，Fisher ChenAlert Guide）；其他试剂为分析纯；实验 用 水：Mili-Q纯 化 超 纯 水 （＞18 MΩ）；Oasis HLB，MCX SPE柱（3 mL，60 mg，Waters，美国）；Estela prime HLB SPE柱（3 mL，60 mg，大连沈源检验检测咨询有限公司）。NAL等23种QNs标准溶液（浓度1000 mg/L）；BAL标准品、TRO标准品（纯度≥98%，DR.E有限公司，德国），各取适量，精密称重后，分别溶解在甲醇中，置同一容量瓶中制成BAL、TRO质量浓度为500 mg/L的标准储备液，密封后-20℃储存，工作有效期6个月。

吸取适量各标准储备液制备成500 ng/mL的25种QNs混合标准储备工作溶液，现用现配。

1.2 样品前处理 称取5 g饲料样品（精确到0.01 g），在50 mL聚丙烯离心管中，加入一定量的混合内标备用工作液，旋转混匀10 s。加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，涡旋混合1 min，超声提取30 min；，离心3 min（转速9000 r/min）。取5 mL上清液，注入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，接收于10 mL离心管中，用氮气吹扫至近干（40℃）。加1 mL的0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）复溶液，涡旋30 s使其重新溶解。用0.22 μm尼龙滤膜过滤，然后用UPLC-MS/MS测定，对照组样品处理方法同上。

1.3 色谱与质谱条件

1.3.1 液相色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B-有机相，为0.1%甲酸乙腈；遵循梯度洗脱程序（表2）；样品进样量为10 μL；柱温为25℃。

表2 液相梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件 质谱离子源为电喷雾源，正离子（ESI+）电离模式；毛细管电压：3.5KV；离子源温度（TEM）：150℃；多反应监测（MRM）扫描；气体雾化温度：380℃；辅助气：50 psi；气帘气：50 psi；锥孔气、脱溶剂气：氮气；采集前调试各参数，达到最佳灵敏度。25种QNs保留时间、质谱参数见表3。数据采集和处理使用MassLynx 4.1软件完成。

表3 25种QNs保留时间和质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择QNs分子结构中都含有哌嗪氮基以及羧基，此类化合物在酸性溶液中呈阳离子模式。在质谱选择正离子模式下，容易形成[M+H]-离子。因此采用ESI+电离源，根据喹诺酮类药物的酸碱两性化学性质，其解离状态根据pH的变化而呈现不同，流动相的pH对喹诺酮类药物在色谱柱中的分离和保留有很大影响。在流动相中添加适量的甲酸溶液可有效提高ESI+的电离效率，有效改善峰形。最终选择ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱对25种QNs进行分离，将0.1%甲酸的水溶液和0.1%甲酸的乙腈用作流动相。由于需要检测QNs数量较多，等梯度洗脱无法有效分离这些药物，因此，通过梯度洗脱来实现各分析物有效分离，各分析物的分析时间范围为3.82 min（吡哌酸）～8.99 min（萘啶酸）。色谱图如图1所示。在10 min内可以完成25种QNs有效分离。

2.2 提取溶剂选择 根据已有的QNs残留监测研究，针对不同的基质，采用不同溶液来提取目标成分。主要可以归纳为有机溶剂提取和混合溶液提取（Pena等，2010；Rodriguez等，2008）。目前从饲料中提取喹诺酮的研究仅有少数报道，根据其他基于饲料分析报告，本研究选择不同的提取溶剂研究饲料中QNs的提取效率，其中NAL、PPA、ENR和MOX分别作为不同代开发药物的QNs代表。比较了HCL溶液（0.1 mol/L）、，磷酸缓冲液（1 mol/L）、乙腈（色谱纯）、蛋白酶溶液（10 g/L）、0.1%TFA-甲醇溶液和1%甲酸乙腈对四代QNs的提取回收率。各化合物不同提取方法的回收效率如图2所示。结果表明1%甲酸乙腈对四代QNs的提取回收率有较好的提取效果。

图2 不同提取液对各代QNs的提取效率

2.3 净化条件选择 实验考察了MCX、HLB和PRiME HLB固相萃取小柱进行净化富集效果的比较。结果表明，1%甲酸乙腈提取后化合物在MCX柱中部分保留，但均难以洗脱，回收率偏低。HLB柱可耐受pH范围较广，有较好的适用性，但HLB萃取柱需要1%甲酸乙腈浓缩成水相溶液，后续同时完成25种QNs复溶定容定量操作误差较大，回收率不能全部达到较理想区间。Oasis PRiME HLB是一种新型开发应用的反相固相萃取吸附剂，无需活化和平衡步骤，去除蛋白、盐、磷脂等95%以上的基质干扰物，样品更洁净，基质效应更小，方法更加稳定可靠且操作方便，仪器维护更轻松，使得溶液流速更顺畅更快速，节省时间和溶液。因此最终选用Oasis PRiME HLB作为1%甲酸乙腈溶液的净化富集柱。

2.4 基质效应考察 按照既定方法称量空白饲料样品并进行处理，然后使用空白饲料样品提取液制备一系列浓度不同的基质匹配标准溶液测定；同时将QNs混合标准工作液使用0.1%甲酸-乙腈（9：1，V/V）溶液稀释成一系列浓度曲线测定；检查溶剂标准曲线和基质匹配曲线的斜率之比，以评估基质效果。结果表明，饲料提取后基质抑制效果，为准确起见，采用基质曲线作为线性验证计算。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性及定量计算 用提取净化后的空白样品提取液将标准工作液逐级稀释，配制为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL系列浓度工作液，在已设定条件下用UPLC-MS/MS分析测定，通过将基质标准工作溶液浓度作为水平坐标（x）和定量离子峰面积响应值作为垂直坐标（y）进行线性回归来计算结果，并绘制标准曲线。表4中显示了典型的线性回归方程式和相关系数。

表4 25种QNs的线性、LOQ和LOD

2.5.2 检出限与定量限 称取10份不同类型的空白样品，按照以上方法处理后测定，通过Mass-Lynx 4.1计算软件信号强度（S）背景噪音强度（N）比值，QNs的检测限浓度（LOD）为信噪比3倍（S/N＞3）时确定，QNs的定量限浓度（LOQ）为信噪比10倍（S/N＞10）时确定。25种QNs的LOQ与LOD见表4。

2.5.3 回收率与精密度 称取空白配合饲料、浓缩饲料样品，按照低、中、高三个浓度添加标准溶液，按照以上建立的方法提取处理后仪器测定。每个浓度进行6次重复，并不同日间3批次重复测定。相对回收率用于检验方法的准确性，相对标准偏差用于评价方法的精度。结果如表5所示。在10、100、200 ng/g添加水平，方法回收率为74.0%～98.6%，相对标准偏差均小于15%。

表5 饲料中25种QNs的回收率和精密度

3 结论

本文建立了应用超高效液相色谱－串联质谱法测定饲料中25种QNs的快速确认方法。样品中QNs用0.1%甲酸乙腈提取，经PRiME HLB固相萃取柱净化后，上HPLC-MS/MS分析，用0.1%甲酸水与乙腈做流动相，梯度洗脱。此方法灵敏度高、操作简单、定量准确、测定浓度范围宽，适用于各种饲料25种QNs的检测。