饲用嗜酸小球菌液体生料发酵工艺研究

王小姣， 杜全能， 陈思宇，朱文娟，胡 超， 兰时乐*

（1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）

饲用嗜酸小球菌液体生料发酵工艺研究

王小姣1， 杜全能1， 陈思宇2，朱文娟2，胡 超2， 兰时乐2*

（1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）

为提高嗜酸小球菌液体发酵的活菌数，本试验采用生料发酵技术和单因素试验法研究了发酵培养基组成以及发酵条件对嗜酸小球菌活菌数的影响，并采用正交试验法对发酵条件进行优化。结果表明：适宜的发酵培养基配方和条件为葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨 0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、发酵温度40℃、种龄60 h、接种量20%。在上述优化条件下发酵36 h，嗜酸小球菌的活菌数对数值为11.258 lg cfu/mL。研究结果显示了液体生料发酵技术适合于饲用嗜酸小球菌的生产。

嗜酸小球菌；生料发酵；活菌数；单因素试验；正交试验

嗜酸小球菌（Pediococcus acidilactici），又名乳酸片球菌，是一种无芽孢、革兰氏染色阳性乳酸菌，其分布范围较广，目前已从人的粪便（Mathys，2009； Millette，2008）、酸马奶（郝彦玲，2009）、发酵香肠（Albano 和 Cosansu，2007）、羊的瘤胃（Cobos，2011）、 牛 粪 （Rodriguez-Palacios，2009） 等 样品中分离得到，并对其产乳酸片球菌素进行了大量的研究，且取得了一系列的研究成果。嗜酸小球菌作为动物益生菌，其安全性和益生性已得到国际主要权威机构的认证，是专业被选择用来改善动物消化道微生态系统的安全、环保饲料添加剂（余德光，2008）。关于嗜酸小球菌在动物上的应用，国内在日本鳗鲡（余德光，2008）、凡纳滨对虾（余德光，2006）、鳜（夏耘，2016）的生长和免疫功能、体液免疫因子以及肠道微生物构成等方面进行了研究，结果表明，嗜酸小球菌能有效促进水生生物的生长，提高免疫力和抑制鳜仔稚鱼肠道内病原菌的繁殖，显示了嗜酸小球菌在动物养殖中良好的应用前景。本研究以嗜酸小球菌为研究对象，通过生料发酵技术和单因素试验法研究嗜酸小球菌液体发酵培养基组成以及发酵条件，并采用正交试验法对发酵条件进行优化，以期为嗜酸小球菌的规模化生产及其在动物饲养中的推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 嗜酸小球菌，由健康的杜×长×大三元杂交商品猪肠道中分离。

1.1.2 培养基 斜面培养基：大豆蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母抽提粉0.5%，乳糖2%，葡萄糖2%，碳酸钙1%，pH 5.8~6.2。

种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏 1%，酵母提取粉 0.5%，葡萄糖 2%，Tween80 0.1%，K2HPO40.2%，无水乙酸钠0.5%，柠檬酸二铵0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·H2O 0.025%，pH 6.2~6.6。

以上培养基均在112℃条件下灭菌30 min。

基础发酵培养基：葡萄糖3%，酵母粉0.4%，无水乙酸钠0.5%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.15%，NaC1 3%，pH自然。

1.1.3 主要仪器与药品

1.1.3.1 主要仪器设备：电子天平（TMP-510，湘仪天平仪器设备有限公司）；分析天平（AL204，梅特勒—托利多仪器有限公司）；细菌培养箱（MJ-160C，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；高压灭 菌 锅 （SS-325，TOMY.KOGYO.CO，LTD）； 单 人单面超净工作台（SW-CJ-1B（U），苏州设备净化有限公司）。

1.1.3.2 主要药品：牛肉膏、蛋白胨（BP，上海盛思生化科技有限公司）；酵母提取粉（BP，北京兰伯瑞生物技术有限责任公司）；柠檬酸二铵、葡萄糖、四水硫酸锰、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、无水乙酸钠、吐温80、乳糖、氢氧化钠 （AR，国药集团化学试剂有限公司）；琼脂（BP，合肥博美生物科技有限责任公司）；大豆蛋白胨（BR，国药集团化学试剂有限公司）；碳酸钙（AR，上海泗联化工厂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养 斜面培养：将保存于4℃冰箱的嗜酸小球菌接种于新鲜的斜面培养基上，于37℃恒温培养3~5 d，备用。

液体种子培养：将培养3~5 d的斜面菌种接种于装有100 mL/250 mL三角瓶中的液体种子培养基中，于37℃下恒温静置培养36 h，备用。

发酵培养：将培养成熟的液体种子，按15%（V/V）接种量接种于发酵培养基中，于37℃下静置培养2 d。

1.2.2 发酵培养基筛选 培养条件用1.2.1中的发酵培养，在单因素试验基础上，替换基础发酵培养基中的葡萄糖、酵母提取粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、乙酸钠、氯化钠的添加量，考察其对嗜酸小球菌活菌数的影响。

1.2.3 发酵条件的筛选及优化 在发酵培养基筛选试验结果的基础上，分别改变发酵温度、种龄、接种量、发酵时间等发酵条件，考察其对嗜酸小球菌活菌数的影响，并采用正交试验法对影响活菌数较大的发酵条件进行优化。正交试验设计如表1。

表1 因素水平表

1.2.4 活菌数的测定 参照杨文博（2004）提供的方法对发酵液中的活菌数进行测定，活菌数以对数值表示。活菌数计算公式：

活菌数对数值 （lg cfu/mL）=某一稀释度下的平均菌落数×稀释倍数×1/V；

式中：V为接种体积，mL。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的筛选

2.1.1 葡萄糖添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响改变基础发酵培养基中的葡萄糖添加量，分别加入2%、2.5%、3%、3.5%、4%的葡萄糖，于37℃下静置培养2 d，测定活菌数。结果见图1。

图1 葡萄糖添加量对活菌数的变化曲线

图1结果表明，在一定范围内，随着葡萄糖添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌数随之增加。当葡萄糖添加量为2.5%时，嗜酸小球菌活菌数对数值达到8.778 lg cfu/mL。但葡萄糖的添加量继续增加，嗜酸小球菌活菌数下降明显。主要原因可能为葡萄糖添加量过大，改变了培养基中的C/N，从而影响了嗜酸小球菌的生长。

2.1.2 酵母提取粉添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响 改变基础发酵培养基中酵母提取粉的添加量，分别加入 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的酵母提取粉，于37℃下静置培养2 d，测定活菌数，考察酵母提取粉添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响。结果见图2。

图2 酵母提取粉的添加量对活菌数的变化曲线

从图2中可以看出，随着酵母抽提粉添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌数也随之增加。当酵母抽提粉添加量为0.3%时嗜酸小球菌活菌数对数

值达到9.152 lg cfu/mL。

2.1.3 蛋白胨添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响在上述试验结果的基础上，在发酵培养基中分别加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的蛋白胨，其他条件不变，于37℃下静置培养2 d，测定活菌数，考察蛋白胨添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响。结果见图3。

图3 蛋白胨添加量对活菌数的变化曲线

从图3可知，在蛋白胨添加量为0.6%~1.0%时，各处理之间嗜酸小球菌的活菌数对数值无显著差异，且蛋白胨添加量超过0.6%，活菌数呈下降趋势。从生产成本考虑，选择蛋白胨添加量为0.6%进行后续试验。

2.1.4 K2HPO4添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响 在上述试验结果的基础上，分别于发酵培养基中添加 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、的K2HPO4，其他条件不变，37℃下静置培养2 d，测定活菌数。考察K2HPO4添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响。结果见图4。

图4 K2HPO4添加量对活菌数的变化曲线

磷是微生物生长繁殖和代谢不可缺少的营养物质，同时也是蛋白质和核酸合成的必要组成元素。在菌体的生长、繁殖、代谢中起着极其重要的作用。适量的磷有利于菌体生长和产物的代谢，磷过量则会影响微生物的生长。从图4结果可以看出，随着K2HPO4添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌数对数值也随之增加。当K2HPO4添加量为0.15%时活菌数对数值达到最大，为9.226lgcfu/mL。但K2HPO4添加量超过0.15%，嗜酸小球菌活菌数下降。

2.1.5 CH3COONa添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响 在培养基中分别添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的 CH3COONa， 其他条件不变，于37℃恒温条件下，静置培养2 d，测定活菌数。结果见图5。

图5 CH3COONa添加量对活菌数的变化曲线

从图5可知，在一定范围内，随着CH3COONa添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌数对数值显著增加，当CH3COONa添加量为0.6%时嗜酸小球菌活菌数对数值最高。故选择0.6%CH3COONa添加量作为该培养基最适添加量。

2.1.6 NaCl添加量对嗜酸小球菌活菌数的影响改变培养基中NaCl的添加量，分别在培养基中添加 2%、2.5%、3%、3.5%、4%的 NaCl， 其他条件不变，于37℃恒温条件下，静置培养2 d，测定活菌数。结果见图6。

图6 NaCl的添加量对活菌数的变化曲线

一般来讲，无机盐在低浓度下，可以促进微生物的生长，但浓度太高，会起到抑菌或杀菌作用。从图6结果可知，在一定范围内，随着NaCl添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌数对数值增加。当NaCl添加量为3%时嗜酸小球菌活菌数最高，其对数值为9.826 lg cfu/mL。但NaCl添加量超过3%，嗜酸小球菌活菌数略下降。由于本研究采用的是生料发酵技术，培养基未经过高温灭菌，通过添加NaCl来抑制杂菌的生长。如果培养基中添加的抑菌物质浓度太低，杂菌生长旺盛，导致营养物质的消耗、代谢副产物的积累以及生长环境的改变而影响目的菌的生长，但NaCl添加量太大，在抑制杂菌的同时，也抑制了嗜酸小球菌的生长。

2.2 发酵条件的筛选

2.2.1 发酵温度对嗜酸小球菌活菌数的影响 将发酵培养基分别放置于 31、34、37、40、43 ℃， 恒温静置培养2 d，其他条件不变，测定活菌数。结果见图7。

图7 发酵温度对活菌数的变化曲线

细菌生长过程中温度分为最适生长温度、最低生长温度以及最高生长温度。温度过低时，菌体代谢活动降低甚至停止生长；温度过高，导致菌体蛋白质变性、酶失活、核酸结构遭到破坏等，从而影响微生物的生长，甚至导致微生物的死亡。从图7可知，当培养温度为37℃时，活菌数对数值最高，为9.912 lg cfu/mL。

2.2.2 种龄对嗜酸小球菌活菌数的影响 分别将培养 24、36、48、60、72 h 的液体种子接入发酵培养基中，其他条件不变，培养2 d，测定活菌数。结果见图8。

图8 种龄对活菌数的变化曲线

种龄也是影响微生物发酵的主要因素之一。种龄过大，细胞处于衰亡期，菌体代谢活力降低；而种龄过小，接入发酵培养基后，由于种子液中细胞数量少，导致延滞期长，延长了发酵周期。从图8结果可知，在种龄24~48 h，嗜酸小球菌活菌数对数值随种龄的增加而增加。当种龄为48 h时，活菌数对数值最高，为10.253 lg cfu/mL。

2.2.3 接种量对嗜酸小球菌活菌数的影响 按体积比 （V/V）分别在发酵培养基中接入10%、15%、20%、25%、30%的液体种子，其他条件不变，37℃发酵2 d，测定活菌数。结果见图9。

从图9可知，嗜酸小球菌活菌数对数值随接种量的变化明显。当接种量为20%时，活菌数对数值为10.869 lg cfu/mL。当接种量超过20%，活菌数明显下降。接种量过大，由种子液带到发酵培养基中的副产物过多，同时前期菌体量过大，物质消耗过快，从而影响或抑制微生物的生长。

2.2.4 发酵时间对嗜酸小球菌活菌数的影响 将发酵培养基置于37℃培养箱中发酵，分别于24、36、48、60、72 h 取样，测定活菌数。 结果见图 10。

图9 接种量对活菌数的变化曲线

从图10可知，当发酵时间为48 h时，活菌数对数值最大，为10.815 lg cfu/mL。培养时间超过48 h，活菌数降低。可能是因为随着培养时间的延长，培养基中营养物质逐渐消耗，代谢产物大量积累。同时，嗜酸小球菌通过对糖的代谢产生大量乳酸而使培养基pH值下降，导致菌体停止生长甚至死亡。

图10 发酵时间对活菌数的变化曲线

2.3 培养基发酵条件优化 在单因素试验基础上，选择发酵温度、种龄、接种量、发酵时间进行四因素三水平正交试验。试验结果见表2。

由表2极差R可知，影响嗜酸小球菌活菌数各因素的主次关系为A＞D＞C＞B，即发酵温度＞发酵时间＞接种量＞种龄。嗜酸小球菌液体发酵最优条件组合为A3B3C2D1，即嗜酸小球菌适宜的发酵条件为发酵温度40℃、发酵时间60 h、接种量20%、种龄36 h。活菌数对数值为11.258 lg cfu/mL。

3 讨论与结论

培养基营养成分和发酵条件对微生物发酵过程能产生重要的影响 （Carvalho和Mapari，2005；闵丽娥，2001）。如培养基中碳源、氮源种类及比例、碳氮比、培养温度、培养基的初始pH、接种量、种龄、培养时间等。许多研究表明，通过对培养基组成和发酵工艺参数的优化，能显著提高发酵液中的细胞浓度（朱承亮，2008；Chiara，2003）。 乳酸菌制剂有效活菌数是衡量其应用效果的主要指标。目前，微生物的发酵方式从灭菌与否可分为熟料发酵和生料发酵。由于生料发酵具有生产工艺简单且能耗低、营养成分破坏少等优点，越来越受到微生物工作者的重视。嗜酸小球菌是一种乳酸菌，已有研究表明，该菌在动物养殖上具有很好的益生效果（夏耘等，2016；余德光等，2006、2005），但嗜酸小球菌的发酵培养基组成和发酵条件，特别是生料发酵工艺的研究鲜见报道。本研究以从健康猪肠道中分离的嗜酸小球菌为研究对象，采用液体生料发酵技术，研究了发酵培养基组成和发酵条件对嗜酸小球菌活菌数的影响，在此基础上，采用正交试验法对嗜酸小球菌的培养条件进行优化，得出适宜的发酵培养基组成和发酵条件为葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、发酵温度40℃、种龄60 h、接种量20%、发酵时间36 h。在此培养条件下，嗜酸小球菌活菌数对数值为11.258 lg cfu/mL。

表2 正交试验结果

[1]郝彦玲，黄荣，赵潞，等.新疆酸马奶中乳酸片球菌所产细菌素05-8的理化特性及分子量确定[J].中国乳品工业，2009，11：12～14.

[2]闵丽娥，刘克武，黄裕村，等.几种碳源和维生素对红曲生理活性物质生成的影响[J]．酿酒科技，2001，2：23 ～ 24．

[3]夏耘，余德光，谢骏，等.养殖水体添加嗜酸小球菌对鳜发育过程肠道微生物构成的影响[J].淡水渔业，2016，46（6）：71 ～ 76.

[4]杨文博 主编.微生物学实验[M].北京：化学工业出版社，2004.

[5]余德光，谢骏，王广军，等.嗜酸小球菌对日本鳗鲡生长和免疫的影响[J].湛江海洋大学学报，2005，25（4）：14 ～ 17.

[6]余德光，朱红友，王广军，等．嗜酸小球菌对凡纳滨对虾体液免疫因子的影响[J].海洋水产研究，2006，27（5）：51 ～ 55．

[7]朱承亮.乳酸菌高密度培养技术的研究：[硕士学位论文][D].杭州：浙江大学，2008.

[8]Albano H，Todorov SD，van Reenen CA，et al.Characterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidi/actici isolated from “Alheira”，a fermented sausage traditionally produced in Portugal[J].Int J Food Microbio1，2007，116（2）：239 ～ 247.

[9]Cosansu S，Kuleasan H，Ayhan K，et al.Antimicrobial activity and protein profiles of Pediococcus spp.isolatedfrom Turkish"Sucuk"[J].Journal of Food Processing and Preservation，2007，31（2）：190 ～ 200.

[10]Cobos MA，Ley de Coss A，Ramirez N D，et al.Pediococcus acidilactici isolated from the rumen of lambs with rumen acidosis，16SrRNA identification and sensibility to monensin and lasalocid[J].Res Vet Sci，2011，90（1）：26 ～ 30.

[11]Carvalho J C，Oishi B O，Pandey A，et al.Biopigments from Monascus：strain selection citrinin production and color stability[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，2005，48： 885 ～ 894.

[12]Chiara S ，Vincenzo A ，Vivien V，et al.Cell density cultivation of probiotics and lactic acid production[J].Biotechnology and Bioengineering，2003，82（2） ：213 ～ 222.

[13]Mathys S，Meile L，Lacroix C.Co-cultivation of abacteriocin-producing mixed culture ofBifidobacterium thermophilum RBL67 and Pediococcus acidi/actici UVA1 isolated from babyfaeces[J].JAppl Microbio1，2009，107（1）：36 ～ 46.

[14]Millette M，Dupont C，Shareck F，et al.Purification and identification of the pediocin produced by Pediococcus acidilactici MM33，a new human intestinal strain[J].Appl Microbio1，2008，104（1）：269 ～ 275.

[15]Mapari S A S，Nielsen K F，Larsen T O，et al.Exploring fungal biodiversity for the production of water～soluble pigments as potential natural food colorants[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16：231 ～ 238.

[16]Rodriguez-Palacios A，Staempfli H R，Duffield T，et al.Isolation of bovine intestinal Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici with inhibitory activity against Escherichia coli 0157and F5[J].Journal of Applied Microbiology，2009，106（2）：393 ～ 401.■

In order to improve the viable count of Pediococcus acidilactici by using liquid-state fermentation，the effects of the cultural medium compositions and fermentation conditions on the viable count were studied by using single-factor experiments with the viable count as index.Then the fermentation conditions were optimized by using orthogonal experiment.The results showed that the optimizal medium compositions and fermentation conditions were as follows：glucose 2.5%，yeast extract 0.3%，peptone 0.6%，K2HPO40.1%，CH3COONa 0.6%，NaCl 3%，fermentation temperature 40 ℃，the seed age 60 h，the inoculation amount 20%and the fermentation time 36 h.Under these conditions cultured for 36 h，the viable count of Pediococcus acidilactici reached 11.258 lg cfu/mL.It showed that the liquid fermentation technology was suitable for the production of feeding Pediococcus acidilactici.

Pediococcus acidilactici；uncooked material fermentation；viable count；single-factor experiment；orthogonal experiment

S816.3

A

1004-3314（2017）21-0016-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172104

湖南省重点研发项目（2016NK2103）；湖南农业大学东方科技学院大学生创新项目（DFCXY201454）

*通讯作者