饲料中隐蔽呕吐毒素研究进展

杨 信， 李布勇， 范小平， 李庆霞， 杨绮纹

（海南省动物疫病预防控制中心，海南海口 570203）

饲料中隐蔽呕吐毒素研究进展

杨 信， 李布勇*， 范小平， 李庆霞， 杨绮纹

（海南省动物疫病预防控制中心，海南海口 570203）

呕吐毒素是镰刀菌属毒素中的一种，在饲料原料中通常会被衍生为乙酰化和糖基化形态，统称为隐蔽呕吐毒素。本文主要对饲料中隐蔽呕吐毒素的形成机制、检测方法、污染分布情况、毒性机理、以及体外和体内的毒性进行了综述。

隐蔽呕吐毒素；检测方法；污染分布；体外毒性；体内毒性

脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又称呕吐毒素（DON），是一种主要由镰刀菌属产生的毒性代谢产物，属于B类单端孢霉烯毒素，其对谷物的污染程度位于镰刀菌毒素之首，对动物健康威胁巨大，尤其对猪的危害最大，其中毒症包括拒食、呕吐、免疫抑制和繁殖障碍等（陈继发，2016）。DON多分布于玉米、小麦、大麦等谷物中，在玉米加工副产物DDGS、玉米蛋白饲料中含量呈累积增加的趋势。目前我国农业部公告中对饲料中DON的限量标准为1000 μg/kg，但是对饲料原料玉米、小麦及副产物中尚没有限量标准。

饲料中呕吐毒素通常和其衍生化形态共同存在，也被称为隐蔽呕吐毒素。衍生化形态包括乙酰化形式3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3ADON），15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15ADON）和糖基化形式脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON3G），不同修饰形态的呕吐毒素具有相同的基本分子式，但是其特征功能团不同（He，2010）。

近年来大量试验发现饲料中隐蔽呕吐毒素对动物的毒性不容忽视。本文就隐蔽呕吐毒素的形成机制、检测方法、污染分布情况、毒性机理，以及体外和体内的毒性研究进行了综述。

1 隐蔽呕吐毒素形成机制

植物被无法降解的霉菌毒素感染后，会启动自身防御机制来降低霉菌毒素对其的伤害，机制分为三个阶段：第一阶段激活，毒素被水解和氧化，将亲脂性的部分转为亲水性，为第二阶段做准备；第二阶段修饰，毒素被内源性的谷胱甘肽、糖、氨基酸、硫酸盐、乙酰基修饰，进一步加强极性和亲水性；第三阶段隔离，被修饰的霉菌毒素经过ATP-谷胱甘肽转移作用转移到液泡、非原质体（细胞壁、细胞间隙）中来降低霉菌毒素对植物的伤害（Coleman，1997）。呕吐毒素由于其亲水性，其在植物体内的转化直接从第二阶段开始，主要形成乙酰化的3ADON、15ADON和葡糖苷化的DON3G。经过修饰的呕吐毒素会一直存在于植物原料内，并会随着食用、消化和吸收而产生毒性来损害家畜。

2 隐蔽呕吐毒素的检测方法

目前对隐蔽呕吐毒素的检测方法主要是液相色谱串联质谱法（表1），提取液一般为乙腈/水（84/16），Zbynek和 Dzumand 等（2014）用 0.1%甲酸水/乙腈（50∶50）提取液也达到了很好的提取效果；提取方式一般采用超声或振荡处理，但时间一般不低于30 min。3ADON、15ADON和DON3G在基质玉米、小麦、配合饲料中均呈基质抑制效应，因此需选择合适的净化体系降低杂质对检测准确性的影响，国内净化主要采取SPE萃取小柱（Mycospin 400多功能净化柱），国外采取直接提取不净化或采用QuEChERS净化体系，包括采用硫酸镁、正己烷、C18吸附的净化剂，但是各种净化体系并不能很好的减少基质效应对测量的影响，因此建议采取不同基质匹配校准标准溶液来定量，从而获得更好的回收率。Zbynek（2014）证明，C18吸附剂虽然不能消除基质效应的影响，但是能明显吸附饲料中的脂内物质来降低对色谱柱的影响，因此在检测中建议加入净化步骤而不是直接提取稀释后上机检测。

表1 隐蔽呕吐毒素的不同检测方法

3 隐蔽呕吐毒素在饲料原料和饲料成品中的污染情况

随着液质技术的发展，目前关于隐蔽呕吐毒素在饲料原料和饲料成品中的污染状况研究报道较多（表2）。研究表明ADON+15ADON在681份小麦样品中检出最大值为14604.2 μg/kg，平均值为 7983.5 μg/kg， 检出率为63.2%，DON3G在 30份小麦中检出最大值为730 μg/kg，平均值为174 μg/kg，检出率为 83.3%，Zachariasova等（2014）在猪配合饲料中对3ADON、15ADON和DON3G均有不同程度的检出，随着对隐蔽呕吐毒素在饲料原料、成品污染的现状和其毒性的进一步认识，建议对我国饲料原料和成品中隐蔽呕吐毒素的污染情况和其合理的限量标准进行研究。

表2 饲料原料和成品中隐蔽呕吐毒素的含量

4 呕吐毒素的毒性机理

目前乙酰化和糖基化呕吐毒素的关注点主要在于是否被体内吸收转化为原型产生毒性，以及本身是否有毒性。因此关注呕吐毒素原型毒性的主要产生机理，有利于对隐蔽呕吐毒素的毒性进行评价。

4.1 呕吐毒素的核糖体应激反应 研究证明，DON能同核糖体的60S亚基结合。DON的3-羟基基团能同核糖体60S亚基A-面上的镁原子和核苷酸结合（Pierron，2016），同时 Pierron（2016）还发现，DON的第3位、12位、15位分别能同核糖体上肽基转移酶中心上的核糖体形成氢键。DON与核糖体结合后，首先激活蛋白激酶（PKR）、斯裂原活化蛋白激酶（MAPKs），进而激活双链上游关键传感器（RNAPKR）。激活PKR后会触发以下机制：（1）通过激活肿瘤抑制基因（P53)、氨基末端激酶（JNK）、P38 蛋白、核因子 kB （NF-kB)而对细胞分化和凋亡产生影响；（2）使真核启动子2α磷酸化而抑制蛋白翻译，从而影响蛋白质的合成来产生介毒性；（3）通过激活信号传导因子、转录激活子、干扰素调节因子来影响基因表达，进而通过调控细胞生长、变异、凋亡而引起机体各种生理反应。

4.2 氧化应激导致细胞凋亡和DNA损伤反应呕吐毒素能导致细胞内产生大量的活性氧，而导致细胞凋亡和 DNA 损伤（Mishara，2014）。 Krishnaswamy等（2010)报道，人结肠细胞经DON感染24h后，活性氧含量大量增加，谷胱甘肽过氧化物酶、抗氧化酶、过氧化物歧化酶的活性降低，同时诱发环氧酶的表达和核转录因子NF-kB的磷酸化而引起细胞凋亡和炎症反应。

5 乙酰化呕吐毒素的毒性

5.1 乙酰化呕吐毒素（3ADON、15ADON）的体外毒性 目前体外研究报道均证实，乙酰化呕吐毒素能同呕吐毒素一样直接产生毒性作用，毒性从强到弱依次为DON≈15ADON＞3ADON。Nathn Broekaert等（2016）证实，乙酰化呕吐毒素能影响动物肠道上皮细胞的增殖和发育，其采用流式细胞术研究原型呕吐毒素和乙酰化呕吐毒素对体外小肠上皮细胞的毒性发现，其对小肠上皮细胞的毒性为：DON≈15ADON＞3ADON。Pinton 等（2014)报道，同对照相比，DON、3ADON和15 ADON分别能使猪肠道上皮细胞（IPEC-1）增殖指数在24 h内降低 60%（P＜ 0.001），13%（P＜ 0.05） 和 69%（P＜0.001）， 其中10 μM的15 ADON能使紧密连接蛋白的表达降低40%。试验还发现DON、3ADON和15ADON均能激活IPEC-1上MAPKS的活性，继而产生炎性反应。

3ADON和15ADON还能影响细胞的生长。Alassane-Kpembi（2015)等采用 MTT比色法研究DON、3ADON和15ADON对人克隆结肠腺细胞（Caco-2）生长的影响，结果表明，DON和15ADON 的 80%抑制浓度（EC80）为 16.5 μmol/L和10.5 μmol/L，3ADON也能抑制Caco-2的活性，但是其毒性要低于DON和15ADON，其EC80为125 μmol/L。 而 Ana Juan-García（2015）发现，对于Hep G2细胞生长，3ADON毒性要大于15ADON，其采用MTT比色法研究对Hep G2细胞生长的影响 发 现 ，3ADON 的 IC50 为 3.6 ～ 6.2 μmol/L，15ADON的 IC50为5.2～8.1 μmol/L。

5.2 乙酰化呕吐毒素（3ADON、15ADON）的体内毒性 通过体内饲养试验发现，3ADON和15ADON分别被肉鸡和猪采食后均能被吸收和分解成DON原型而产生毒性，但是肉鸡对3ADON和15ADON的耐受性要大于猪。Nathan Broekaert等（2015）报道，DON、3ADON 和 15ADON 被肉鸡采食后，吸收率分别为10.6%、18.2%和42.2%。3ADON被吸收后全部分解为 DON，75.4%的15ADON被吸收后分解为DON，故3ADON和15ADON在被家禽吸收后会分别转化为18.2%和31.9%的DON而对机体产生毒性。同时由于15ADON会产生更多的DON原型被吸收，故对于肉鸡，15ADON的毒性被认为还要大于DON。对于猪，DON、3ADON和15ADON被采食后完全被吸收，而且完全分解为DON产生毒性，故对于猪，3ADON和15ADON的体内毒性不容忽视。

6 糖基化呕吐毒素的毒性

6.1 糖基化呕吐毒素（D3G）的体外毒性 由于D3G中的葡萄糖苷基团形成的空间位置阻碍，D3G不能像DON一样同核糖体60S亚基A-面上的肽基转移酶中心结合，而直接产生毒性。体外试验证明，DON3G的直接毒性要远低于DON，Alix Pierron等（2015）对人小肠Caco-2细胞进行体外试验发现，D3G不能激活JNK和蛋白激酶（MAPK）而产生毒性。 Pierron等（2015）研究 DON和DON3G对Caco-2细胞生长的影响，48 h后，DON 的半抑制浓度（IC50）为 1.3 μmol/L，与此对比，10 μmol/L的 DON3G对 Caco-2细胞生长不产生任何毒性。

6.2 糖基化呕吐毒素（D3G）的体内毒性 体外试验证明D3G基本不产生毒性，对其毒性的评价主要集中在D3G被采食后是否能转化为DON原型而对动物产生毒性。试验证明D3G被采食后可形成DON原型。

Veronika（2014)等分别在第 1、5 天和 9 天对断奶仔猪强饲对照日粮、D3G （116 μg/kg·BW）和DON（75 μg/kg·BW）的日粮，并在饲喂后 24 h 对尿液和粪便全收集，分析尿液和粪便中的DON、D3G和其他代谢产物。结果发现粪便中基本回收不到DON及代谢产物，回收集中在尿液中，其中单独饲喂含DON日粮断奶仔猪尿中总回收84.9%，分别为51.4%DON，19.0%DON-3-GlcA和14.5%DON-15-GlcA，单独饲喂含D3G日粮，尿液中出现了DON原型，总回收为40.3%，其中含 21.6%DON，3.4%DON-3-GlcA，6.8%DON-15-GlcA，5.9%DOM-1，2.6%D3G。 表明采食 D3G 的生物活性要低于DON，从回收看只占DON的一半左右。但是D3G在被吸收后可释放出糖苷配基产生原型DON，并被吸收和参与体内代谢而产生毒性。同时单独饲喂含D3G猪尿液中的产物出现了单独饲喂DON中并没有产生的DOM-1，在猪的消化吸收途径中，DOM-1主要是通过猪尾肠的微生物分解DON而产生，因此可以推测单独饲喂DON时，DON基本都是在近端被小肠吸收，进而代谢，而D3G则部分进入尾肠，被分解为DON原型产生毒性，在尾肠中DON代谢途径包括修饰为DON-3-GlcA和DON-15-GlcA，也可以分解为DOM-1被解毒。

Nathan Broekaert等（2017）通过体内试验测定血浆中的DON和其代谢物，D3G被肉鸡采食后并不能降解为DON原型，但是DON被采食后，在血浆中可检测到DON的硫酸盐化产物DONS，D3G被猪采食后，血液中可检测到DON原型和DON-GlcA产物，但是D3G被采食后的吸收程度（16.1±5.4）%要低于 DON（81.3±17.4）%。 因此，DON在猪体内的第二阶段修饰主要为葡糖苷酸化（Veronika等，2014），在鸡体内则主要是硫酸盐化，同时DON代谢中第二阶段的修饰作用在鸡体内更为广泛，这也可能是鸡比猪耐受DON毒性能力强的原因。

7 小结

综上所述，隐蔽呕吐毒素在饲料中的污染情况不容忽视，应用液相色谱串联质谱法检测其含量时一定要考虑基质效应，定量需要使用基质匹配标准曲线。隐蔽呕吐毒素的体外毒性从强到弱依次为 DON≈15ADON＞3ADON＞＞D3G， 同时饲养试验发现，乙酰化的15ADON、3ADON和D3G均能在猪体内转化为DON原型而产生毒性。目前对于隐蔽呕吐毒素的研究尚不多见，仍有一些问题有待进一步解决，例如：隐蔽呕吐毒素在动物体内的消化、吸收和代谢过程还需要进一步研究，同时研究饲料中不同浓度隐蔽呕吐毒素对动物的毒性作用和生产性能的影响，从而为制定隐蔽呕吐毒素在饲料中的科学限量标准提供技术支撑。

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The deoxynivalenol （DON）is one of the toxins of fusarium，and often derived as acetylated and glucoside forms in feedstuff，which are collectively called hidden deoxynivalenol.In this paper，the formation mechanism，determination，distribution，toxicodynamics，cytotoxicity in vitro and vivo of hidden deoxynivalenol in feed were reviewed.

hidden deoxynivalenol；determination；distribution；cytotoxicity in vitro；cytotoxicity in vitro

S816.9

A

1004-3314（2017）21-0007-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172102

海南省农产品质量安全体系建设项目（UQ74051）

*通讯作者