玉米中呕吐毒素的表面等离子谐振生物传感器检测技术研究

周历岚，米佳飞，王战辉*

（1.中国农业大学动物医学院,北京 100193；2.中粮肉食投资有限公司,北京 100020）

呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是由E镰刀菌属、木霉菌、禾谷镰刀菌等多种真菌产生的次级代谢产物，属单端孢霉烯族化合物。1973年DON结构被阐明（Scarpino等，2015；Yoshizawa等，1973）。其化学名称为 3α，7α，15-三羟基 -12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，是四环的倍半萜（Krska等，2001）。DON在甲醇溶剂中不稳定，室温放置22 d后其TLC发生明显变化，乙腈和乙酸乙酯可做为 DON的长期保存溶剂（Wei等，1986）。DON热稳定性强，对碱性较敏感，经加碱、高压、热蒸汽的处理后可除掉部分毒素（Cenkowski等，2006），延长时间可以去掉全部毒素。不同种类动物对DON的敏感性不同，猪对DON最敏感，在摄入1mg/kg DON后会引起拒食。禽类、反刍动物对DON非常不敏感（Philippe等，2008）。Sypecka等（2004）发现，DON对鸡蛋不造成影响，即使饲料中DON含量高达10 mg/kg，蛋中DON含量依然很低，产蛋量也并未受到影响。

DON是饲料中对畜禽危害最大的真菌毒素之一，可引起畜禽真菌毒素中毒症。因此，检测饲料中DON残留量十分必要。目前，真菌毒素检测方法很多，但都不同程度地存在样品前处理复杂、操作时间长等缺点，因此，探索快速准确的真菌毒素检测方法是当前的研究热点。基于表面等离子谐振（Surface plasmon resonance，SPR）原理开发的传感器利用生物薄膜技术，把具有特异性生物表面基质的目标物印刷在金属膜表面，并且利用生物偶联等方法在基质层上进行修饰特定蛋白，实现对溶液中目标物的检测。该技术具有操作简单、耗样量少、检测时间短、无需标记、灵敏度高，能实时监测反应动态过程，无需纯化各种生物组分，只需对样品进行简单处理的优点，已被应用于化学性危害物的检测领域。然而针对真菌毒素的SPR检测方法报道较少，因此，本研究利用SPR技术制备了传感器芯片，建立DON的SPR检测方法，为快速高通量检测玉米中DON残留提供了新的思路。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂表面等离子谐振仪Interbio S400（北京华安麦科生物技术有限公司）；NanoDrop1000蛋白核酸微定量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher公司）；DZX-3真空干燥箱（上海福玛设备有限公司）；37 ℃恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超净工作台（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-200KD超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FBS210S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA）；卵清蛋白（OVA）；呕吐毒素（DON）；聚乙二醇（PEG，MW4000）；1，1-羰基二咪唑（CDI）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCL）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；二甲基甲酰胺（DMF）；MES购自Sigma公司；羧基修饰的SPR芯片IB-CM来源于北京华安麦科生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1呕吐毒素包被原制备将DON与卵清蛋白（OVA）共价偶联，得到DON的包被原（DONOVA）。具体方法如下：称取5 mg DON标准品，并溶解于1 mL色谱级乙腈中得到DON母液。称8.8 mg 1，1-羰基二咪唑（CDI）加入到 200 μL DON母液中，充分混匀并常温避光反应1 h。称取30 mg OVA，充分溶解于500 μL的偶联缓冲液。

1.2.2羧基芯片表面活化将羧基修饰的SPR芯片IB-CM安装到SPR上，用PBS缓冲液，流速10 mL/min，冲洗芯片表面至基线平稳。再用MES缓冲液，流速10 mL/min，冲洗至基线平稳。取50 mmol/L NHS和200mmol/L EDC、HCL等体积混合，流速1 mL/min，均匀流过芯片表面，活化10 min。

1.2.3抗体结合浓度优化根据芯片载量确定结果，确定0.2 mg/mL的DON-OVA为合适包被浓度。选择不同的DON单克隆抗体，流速为5 μL/mL，从100 μg/L开始，10倍稀释3个梯度反应20 min。根据抗原抗体结合曲线，确定合适的抗体浓度区间。

1.2.4反应时间对DON检测的影响为确定反应时间对SPR检测DON的影响，设计3组处理方式：

处理1：DON标准品与抗体混合物直接流过合成抗原DON-OVA包被的SPR芯片，不做停留。流速为5 μL/min。处理2：DON标准品与抗体混合物流过合成抗原DON-OVA包被的SPR芯片时孵育30 min。进样流速为5 μL/min。处理3：DON标准品与抗体混合物流过合成抗原DONOVA包被的SPR芯片时孵育60 min，进样流速为5 μL/min。每种处理重复3次，根据检测的标准差及反应曲线判定反应时间对DON检测的影响。

1.2.5标准曲线的建立和检测限的确定根据上述实验确定的抗原、抗体工作浓度和反应时间建立SPR标准曲线，操作如下：将DON-OVA抗原用pH 3.6的乙酸盐缓冲液稀释到终浓度为0.2 mg/mL，包被芯片，流速 2 μL/mL，反应 30 min。将芯片用PBST洗液洗涤，流速10 mL/min，洗涤10 min。将芯片用1 M的乙醇胺封闭，流速2 μL/mL，反应30 min。将倍比稀释的DON标准品与DON抗体混合后加入芯片中，5 μL/mL流速。根据检测值建立标准曲线和检测限。

1.3玉米样本中呕吐毒素检测

1.3.1玉米样本的处理取自然污染DON的玉米样本，参考GB/T 14699.1采样，按GB/T 20195使用四分法将样品缩减至500 g，全粉碎后过1 mm的分析筛，充分混匀后装入真空袋内备用（若放置超24 h需放置在4 ℃冷藏柜中保存）。称取5 g玉米粉，加入25 mL 60%甲醇溶液，震荡混匀20 min，提取后的样本用快速定性滤纸过滤，滤液加入10倍体积的PBS缓冲液稀释。稀释液用0.22 μm的滤膜过滤，过滤后用SPR仪检测。取200 μL稀释后的提取液加入等体积的DON抗体，混合均匀后注入SPR仪检测，5 μL/mL流速，记录检测结果。

1.3.2用于HPLC检测的玉米样本处理称取玉米样本5 g，并过1 mm分样筛，加入5 g聚乙二醇，125 mL蒸馏水；剧烈振荡加入提取液后的样本20 min。用快速定性滤纸过滤，收集滤液；滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液，取2.5 mL上样液过免疫亲和柱净化。将DON免疫亲和柱在室温平衡30 min，上述提取液取2.5 mL流过免疫亲和柱，待液体排干后，将亲和柱用离子水洗涤2次，每次10 mL。待液体排干后，上样1 mL甲醇，流速1滴/s，收集洗脱液并在50～60℃加热条件下氮气吹干，然后用1 mL流动相复溶。复溶液用0.22 μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于HPLC仪器分析。色谱柱：C18柱 ；流动相 ：V（甲醇）：V（水）＝ 20：80；流速 ：1 mL/min；柱温：40℃；紫外检测波长：218 nm。

2　结果与分析

2.1DON单克隆抗体浓度优化选择不同浓度稀释的DON单克隆抗体与DON-OVA包被抗原相结合。根据结合曲线选择合适的抗体稀释浓度，结果见图2。

图2　SPR检测DON抗体浓度优化

从上图可以看出，抗体浓度越高，曲线上升越快，最终的SPR值更高。表明抗体浓度高时，抗原抗体反应速度更快。在抗体浓度为10 μg/L和1 μg/L组可以看出，两个浓度的抗体最终结合后的SPR值相同，但10 μg/L的DON抗体结合速度更快，更容易达到峰值。根据抗体结合速率、结合后的SPR值及抗体的成本，最终选择10 μg/L的抗体浓度作为合适的反应浓度。

2.2竞争反应时间对DON检测的影响主要考察标品与抗体混合液及芯片上的包被抗原的作用时间是否会影响到DON的检测效果。设计不同的反应时间，比较反应曲线变化及检测结果的变异来评估其对DON检测的影响，结果见图3。

从检测结果可以看出，当孵育时间为0时，即标准品与抗体的混合液直接流过DON-OVA包被的芯片，不同检测次数间的偏差较大，检测曲线的线性较差。随着孵育时间延长，不同检测次数间数据变异变小，检测曲线的线性较好。孵育时间为30 min时的灵敏度优于60 min。综合检测的线性区间与方法灵敏度两个因素，选择了孵育30 min作为合适的反应时间。

图3　不同孵育时间对DON检测的影响

2.3SPR检测DON的线性区间与检测限根据上述实验结果，选择10 μg/L的DON单克隆抗体浓度，选择0.5～100 μg/L的DON标准品浓度。取200 μL标准品与等体积的DON单克隆抗体混合后，以5 μL/min注入包被有DON-OVA的SPR芯片中，并孵育30 min。根据SPR信号值与标准品浓度绘制标准曲线，并计算回归方程，结果如图4，计算得出该SPR检测方法的线性范围为0.5～100 μg/L，方法检测限为0.5 μg/L。

曲线相关系数R2=0.9848，回归方程为Y=-156lnx+990.95

图4　SPR检测呕吐毒素的标准曲线

2.4玉米样本检测结果

2.4.1方法检测限的确定检测限由20份空白玉米样品测得的平均值加上3倍的标准差计算而得，由表1计算得到该方法的检测限为96.22 μg/kg。

表1　检出限测定结果统计表 g/kg

2.4.2玉米中呕吐毒素DON添加回收率的测定100、300 μg/kg和 900 μg/kg 3个 浓 度 的 DON添加空白玉米中时，所得到的检测结果见表2，从表中可知回收率为81.8%～111.2%，变异系数均小于15%。

表2　玉米中呕吐毒素添加回收率的测定 %

2.4.3实际样本检测选择DON自然污染的玉米样本，经过样本前处理，用SPR方法检测。同时用HPLC检测作为对比，检测结果见表3。从表中可看出，SPR方法检测DON的结果与标准的HPLC方法相关性良好，R2为0.9581。

表3　玉米样本中呕吐毒素含量检测结果

3　讨论

图5　玉米样品HPLC与SPR相关性分析

Kadoka等（2010）将SPR应用于检测小麦中雪腐镰刀菌醇和DON。Van等（2003）将霉菌毒素用羧甲氧胺半盐酸盐羧基化实现SPR检测。Daly等（2000）第一次将SPR技术应用到AFB1的检测。本研究建立了基于SPR技术的玉米中DON残留的免疫检测分析方法，实现了对玉米中DON的快速非标记检测。为提高检测灵敏度，分别从抗体浓度、反应时间等方面对SPR方法进行优化。选择3种不同浓度的DON单抗，采用10倍梯度稀释单抗。根据SPR反应曲线可知，DON单抗在高浓度时（100 μg/L），反应曲线上升很快，结合后的信号值较高，说明抗体与SPR芯片上的包被抗原结合速率很高，抗原抗体最终的结合量也更高。在抗体浓度降低时，结合曲线变得相对更平滑，说明结合速率下降；同时SPR曲线的峰值也在下降，说明最终的抗体结合量下降。在结合曲线上可以看出，抗体在10 μg/L与1 μg/L时，结合速率有较大差别，但最终的结合量却相同。根据抗原抗体结合速率、成本考虑，选择1μg/L的DON抗体作为合适的抗体工作浓度。

为比较竞争反应时间与检测结果的关系。选择3种不同的反应时间（孵育时间），0 min，30 min和60 min。结果表明，孵育时间主要影响检测结果变异，孵育时间越长，标准差越小。同时，孵育时间也会影响方法的线性范围与灵敏度。总体来说，孵育时间越长，线性区间越宽，线性较好。但孵育时间越长，完成检测的时间就更长。综合考虑检测时间、线性范围与灵敏度等因素，选择孵育30 min作为最终的孵育时间。

4　结论

本研究建立了玉米中DON的SPR检测分析方法。通过优化确定抗体工作浓度为10 μg/kg、确定最适反应时间为30 min。方法检测限为96.22 μg/kg，回收率为81.8%～111.2%，变异系数小于15%。经玉米实际样本测试，SPR检测方法与HPLC方法的相关性良好，R2均大于0.95。

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