饲用淀粉酶产生菌株的筛选及产酶条件优化

贾国宾 ， 李卓伟 ， 杨国辉 *， 魏丽娟 ， 张 沛 ， 王德功 ， 刘 冬

（1.河北远征药业有限公司，河北石家庄 050041；2.河北省兽药工程技术研究中心，河北石家庄050041）

淀粉酶是能够催化淀粉使其水解为葡萄糖、麦芽糖、低聚糖类的一类酶的总称。目前工业生产应用所需的淀粉酶以微生物为主要来源，尤其是以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多 （谢凤行等，2009；张双民，2006）。产淀粉酶芽孢杆菌具有易贮存、耐高温高压、抗逆性强等独特的生物学特性 （辛娜等，2011）。本试验以鸡、猪、牛的小肠黏膜为菌源进行耐胆盐产淀粉酶菌株的筛选，并对其产酶发酵条件进行优化，以为工业生产淀粉酶提供菌株。

1 试验材料

1.1 菌源 健康青年鸡、猪、牛空肠黏膜。

1.2 培养基及试剂 NB培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值7.2～7.4。

0.3%胆酸盐NB琼脂培养基：NB培养基+琼脂2%+0.3%胆酸盐，pH值7.0。

NA培养基：NB培养基+琼脂1.5%～2%，pH值7.2～7.4。

淀粉培养基：可溶性淀粉0.2%，蛋白胨1%，牛肉膏 0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，Na2HPO45%，琼脂1.5% ～2%，NaCl 5%，pH值7.0～7.2。

淀粉酶基础发酵培养基：蛋白胨20.0 g，牛肉浸粉 20.0 g，Na2HPO45.0 g，NaCl 0.1 g，水 1000 mL，pH值7.0～7.4。

生理生化鉴定所用培养基参照 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）。

NaCl、NaOH、HCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaC12、ZnCl2、Cu-Cl2、FeCl2、MnCl2均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 试验方法

2.1 胆酸盐耐受性菌株的分离 无菌条件下剪下屠宰后青年鸡、猪、牛空肠各一小段，分别挤出肠道内容物后纵向剖开，刮取空肠黏膜黏液，涂抹在无菌载玻片上并盛于无菌烧杯内，37℃风干48 h。

烘干后将载玻片上样品放入无菌三角瓶中，并加入无菌生理盐水，利用漩涡振荡器充分振摇，80℃水浴加热15 min后，进行梯度稀释。

取1.0 mL样品进行梯度稀释，分别取适宜稀释度的样品液0.1 mL加入到凝固的0.3%胆酸盐LB琼脂培养基平板内，涂布器均匀涂布后，于37℃生化培养箱中倒置培养24～48 h，从中挑取出具有不同菌落形态的单菌落转接到NA培养基试管斜面上，培养48 h后，4℃保存，备用。

2.2 产酶菌株的初筛 将得到的已保存菌株点种于淀粉培养基平板上，37℃进行培养，24 h后从平皿中选取生长的菌落转接至NA培养基试管斜面，并点种在淀粉培养基上进行培养，培养条件为37℃，时间为48 h。

在培养后的淀粉平板上滴加卢戈氏碘液。记录水解圈直径与菌落直径比值 （H/C值），H/C值较大的菌株即为所需菌株。

2.3 产酶菌株的复筛 将以上所得初筛各菌株接种于装有50 mL NB培养基的250 mL三角瓶中，培养温度37℃、摇床转速180 r/min培养16 h，制成种子液。

将种子液按体积分数6%的接种量接种于装有50 mL淀粉酶发酵培养基的250 mL摇瓶中37℃培养36 h，摇床转速180 r/min。将发酵液在4℃条件下以10000 r/min离心10 min，取上清液制粗酶液。

采用Yoo等（1987）改良法计算酶活力，以在55℃，5 min内水解1 mg（0.5%）淀粉定义为一个酶活力单位。以此为复筛标准，从中选取产酶活性较高的菌株3～4株。

2.4 产酶发酵条件优化 改变基础发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐、缓冲对等成分配制发酵培养基，121℃灭菌15 min，250 mL三角瓶装量50 mL，以6%的接种量接种发酵15 h种子液，37℃、180 r/min发酵培养36 h。并在以测定粗酶液酶活性为主要参考指标的同时测定发酵液吸光度值即菌液OD值进行含菌量测定，以确定菌株的最佳碳、氮源，无机盐及缓冲液的成分，并通过正交试验确定各成分最佳百分比。

3 结果与分析

3.1 芽孢杆菌的分离 在含0.3%胆酸盐LA平板上通过对肠道壁刮取物的培养，共分离出205株耐胆酸盐的芽孢杆菌。其中在淀粉平板上出现水解圈的有56株菌，挑选产淀粉酶活力较高的YZ-ZH03、YZ-ZK22、YZ-JH41、YZ-JH43 和 YZNH65五株芽孢杆菌测定摇瓶条件产酶能力，进行复筛。

3.2 淀粉酶产生菌的筛选 由表1可以看出，在淀粉平板上的点种的5株菌中YZ-ZH03的Hc值高于其他4株菌，而经过粗酶液的酶活力测定，该菌株的酶活力均高于其他菌株，为最优菌株，即选择YZ-ZH03菌株作为进一步研究的对象。

表1 产淀粉酶菌株在淀粉平板的水解淀粉特性和发酵液淀粉酶活性

3.3 产酶条件优化

3.3.1 不同碳源对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度和酶活力的影响 分别以等量淀粉、玉米粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、麸皮替代基础培养基中的牛肉浸粉，在其他成分不变的情况下，按装液量50mL/250mL三角瓶，接种量为2%，37℃、180r/min摇瓶发酵24 h后测定发酵液菌体浓度并计算酶活力大小（图1）。

图1 不同碳源对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度和酶活力的影响

试验结果表明YZ-ZH03菌株以葡萄糖作为碳源时发酵液酶活力大小为94.21 U/mL，与初始培养基发酵液酶活力相比提高了2.80%（P＜0.05），发酵液OD600值为0.587；糊精作为碳源时发酵液酶活力大小为92.52 U/mL，与初始培养基发酵酶活力相比提高了1.00%（P＜0.05），发酵液OD600值为0.572，而其他碳源的选择对酶活力的影响不显著，尤其个别碳源的代替降低了发酵液的酶活力。最终选择葡萄糖为其最优碳源。3.3.2 不同氮源对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 选用上述优化后的最佳碳源，分别以等量大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉、酵母膏、尿素、硫酸铵作为氮源替代基础培养基中的蛋白胨，在其他成分及培养条件不变的情况下测定发酵24 h后各指标值，结果如图2所示。

图2 不同氮源对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明，YZ-ZH03菌株以尿素为氮源时发酵液酶活力为96.60 U/mL，发酵液OD600值为0.604；黄豆饼粉作为氮源时发酵液酶活力大小为94.43 U/mL，发酵液OD600值为0.661，而其他氮源的选择对酶活力的增加效果不明显。统计分析结果表明，尿素作为氮源酶活力提高了5.50%（P＜0.05），对发酵结果影响显著，而其他氮源的替换使发酵效果降低。最终选择尿素为最优氮源。

3.3.3 不同无机盐对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 选用上述优化后的最佳碳源和氮源， 分别添加0.2%的 CaCO3、CuSO4、Zn-SO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 替代基础培养基中NaCl，在其他成分及培养条件不变的情况下测定发酵24 h后各指标值，结果如图3所示。

图3 不同无机盐对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明YZ-ZH03菌株以其他无机盐进行试验，发酵液酶活力均小于初始培养基中所使用的NaCl。最终选择Nacl为最佳无机盐成分。

3.3.4 不同配比缓冲液对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 选用K2HPO4和KH2PO4缓冲对按 0、1∶0.1、0.2∶0.1、0.3∶0.1、0.4∶0.1的比例加入至基础培养基中。测定发酵24 h后各指标值，结果见图4。

图4 不同配比缓冲液对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明，YZ-ZH03菌株以0.4∶0.1作为缓冲液配比的发酵液酶活力大小为101.27 U/mL，发酵液OD600值为0.632，而其他配比的选择对酶活力的增加几乎没有影响。统计分析结果表明，以0.4∶0.1作为缓冲液配比使酶活力提高了10.56%（P＜0.05），对发酵结果影响显著。根据最终分析选择缓冲对最佳配比为0.4∶0.1。

3.3.5 发酵时间对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 选用所选最佳发酵培养成分，按装液量50 mL/250 mL三角瓶，接种量为2%，37℃、180 r/min培养，测定摇瓶发酵 18、24、30、36 h后发酵液菌体浓度及酶活力，结果见图5。

图5 发酵时间对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明，YZ-ZH03菌株在发酵过程中随着时间的延长酶活力逐渐增大，当发酵时间为30 h时酶活力达到最大值109.62 U/mL，发酵液OD值为0.782，自此发酵液酶活力不再增高，当发酵时间为36 h时，出现酶活力降低现象，分析原因可能为部分酶活不稳定所致。统计分析结果表明，选择发酵时间为30 h，酶活力提高了19.67%（P ＜ 0.05）。

3.3.6 发酵温度对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 选用装液量50 mL/250 mL三角瓶、接种量2%、180 r/min，测定摇瓶在36、37、38、39℃发酵30 h后发酵液菌体浓度及酶活力，试验结果见图6。

图6 发酵温度对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明，YZ-ZH03菌株在发酵过程中随着温度的变化其酶活力先增大后减小，当发酵温度为37℃时酶活力达到最大值112.25 U/mL，发酵液OD值为0.751，随着温度的增加发酵液酶活力逐渐降低，统计分析结果表明，选择发酵温度为37℃时发酵液酶活力提高了22.54%（P＜0.05），对发酵结果影响显著。

3.3.7 不同装液量对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 30 h测定装液量分别为30、50、70、90 mL 的 250 mL 摇瓶发酵液各项指标，结果见图7。

图7 不同装液量对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

试验结果表明，当装液量为50 mL时，其酶活力最大，为113.16 U/mL，菌液OD值为0.751，为所有试验组效果最好。分析其原因为适宜的装液量为菌株的生长提供了合适的需氧量促进了菌株的生长。统计分析结果表明，选择装液量为50 mL时，发酵酶活力提高了25.72%（P＜0.05）。

3.3.8 不同摇瓶转速对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响 30 h时测定不同转速对酶活力大小及菌液浓度的影响，结果见图8。

图8 不同摇瓶转速对YZ-ZH03菌株发酵液菌体浓度及酶活力的影响

结果表明，YZ-ZH03菌株培养液在摇床转速为200 r/min时酶活力最大为119.23 U/mL，OD600为0.782，为其培养最佳转速。分析原因为适宜的转速为菌株的生长提供了适宜的发酵液通气量，增加了其溶氧量促进了菌株的生长。统计分析结果表明，选择转速为200 r/min时酶活力提高了30.16%（P ＜ 0.05）。

3.4 正交试验 综合以上各单因素试验结果，选定 K2HPO4∶KH2PO4为 0.4∶0.1，选择葡萄糖、尿素、氯化钠、pH、接种量设计 5因素4水平的 L16（45）正交试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验设计及结果分析

表3 正交试验结果方差分析

依据正交试验的直观分析结果，极差值R接种量＞R尿素＞RNaCl＞RpH值＞R葡萄糖，可得接种量为主要影响因素。由表2可见，3号试验组合酶活力大小最高，为 121.69 U/mL，增长了 32.85%（P ＜ 0.05）。而由均值K得出的最佳组合为A1B3C2D2E3，在正交试验表中没有该组合，通过验证试验证实该组合发酵液的酶活力大小为122.43 U/mL，比未做优化前酶活力提高了33.66%（P＜0.05）。

由表 3 可以看出，F葡萄糖＜F0.05（3.3），即葡萄糖含量对发酵结果影响不显著；F尿素＞F0.05（3.3），即尿素含量对发酵结果影响显著；FNaCl＜F0.05（3.3），即NaCl含量对发酵结果影响不显著；FpH值＜F0.05（3.3），即发酵液pH值对发酵结果影响不显著；F接种量＞F0.05（3.3），即接菌量对发酵结果影响显著。综合分析显示对发酵酶活力影响最大的因素是接菌量。最终确定YZ-ZH03的最佳酶活力培养条件为：葡萄糖1.0%，玉米浆1.5%，NaCl 0.10%，K2HPO40.4%，KH2PO40.1%，初始 pH 6.0，接种量4%。

4 讨论与结论

经过产淀粉酶芽孢杆菌的分离筛选，最终获得一株产淀粉酶活力较强的芽孢杆菌，并对其产酶发酵条件进行优化，结果表明，发酵液酶活力与发酵接种量和氮源的含量有显著相关性，最终确定产酶发酵工艺为：葡萄糖1.0%，玉米浆1.5%，NaCl 0.10%，KH2PO40.4%，KH2PO40.1%，初始pH 6.0，接种量4%，250 mL摇瓶中装液量50 mL，37℃、200 r/min培养30 h。在此条件下，菌株的产酶酶活力由初始的91.60 U/mL提升到122.43 U/mL，提高了33.66%。本试验菌株的获得可以为工业化生产淀粉酶以及微生态饲料添加剂菌株的选择提供一定的参考价值。

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