蒲公英冻干提取物对体外瘤胃发酵的影响

刘雯雯， 朱清册， 蔡 龙， 黄盛东， 张 燕， 王志博

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

蒲公英为多年生草本植物，在我国分布广泛。传统中医学认为，蒲公英具有特别的药用价值，如疗肿、利尿、治疗风湿病和消炎等。蒲公英中含有许多次级植物代谢产物，如皂苷、类黄酮、生物碱类、酚类化合物和类固醇等（Mir等，2013）。研究表明，蒲公英乙醇提取物对葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌均具有抗菌活性（Kenny等，2014）。体外研究发现，蒲公英根可以影响瘤胃发酵（Wencelová 等，2015）。 然而，关于蒲公英提取物调控瘤胃发酵以改善反刍动物的营养利用的潜在性作用的研究较少。因此本试验研究了蒲公英冻干提取物对体外瘤胃发酵和原虫数量的影响。

1 材料与方法

1.1 植物材料和提取物的制备 蒲公英购于当地中草药商。本试验中以水或者乙醇作为蒲公英的提取溶剂。水提取物包括冷水提取物（CAE）和水煎煮提取物（BAE）。乙醇提取物包括30%乙醇提取物（TEE）和70%乙醇提取物（SEE）。冷水提取物制备方法为在室温下用无菌的水将粉碎的蒲公英浸泡24 h。过滤混合物以后去除蒲公英渣，将滤液冻干，所得粉末置于4℃干燥器中储存。沸水提取方法为在室温下以无菌的水浸泡蒲公英2 h，然后沸水提取两次，每次1 h，之后将混合物过滤，冻干滤液和所得粉末在4℃的干燥器中存储。蒲公英于30%或者70%的乙醇中浸泡，收集乙醇浸泡上清液，然后旋转蒸发，冻干，也于4℃条件下贮存于干燥器中。

1.2 试验设计和发酵技术 以三只装有瘤胃瘘管的羊作为瘤胃液的提供者。以100 mL注射器作为体外培养器。根据Menke等（1979）所述方法，注射器中注入30 mL培养基，此培养基由10 mL瘤胃液和20 mL缓冲液组成。将粉碎的羊草（28.3%）、玉米（24.5%）、豆粕（15.5%），以精粗比50∶50的比例混合作为培养基。准确称量200 mg培养基置于100 mL的玻璃注射器中。准确称量200 mg培养基和5 mg蒲公英提取物（CAE、BAE、TEE和SEE）置于每个注射器中。每个采样点设置3个注射器。将注射器在39℃下进行培养。24 h培养结束后，测定培养物的pH、氨态氮、挥发性脂肪酸和原虫的数量。

1.3 体外发酵指标的测定 根据Menke和Steingass（1988）描述，记录培养 2、4、6、8、10、12、16、24 h后的气体产生量。培养24 h后，立即用Sartorious（pH-Meter PB-20）酸度计测定 pH。 取2 mL的发酵液与0.4 mL的250 g/L偏磷酸混合，然后1000 r/min离心10 min。上层清液置于-20℃保存，用以测定氨态氮和挥发性脂肪酸浓度。

根据 Broderick和 Kang（1980）描述的方法，以UV-2401PC分光光度计测定氨态氮的浓度。根据Erwin等（1961）的方法，使用气相色谱仪测定挥发性脂肪酸浓度。以Ogimoto和Imai（1981）描述的方法测定纤毛虫的数量。

1.4 统计分析 以SAS的混合模型对完全随机设计的试验数据进行统计分析。P≤0.05为差异显著，结果以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

由图1可见，蒲公英提取物的添加显著提高了体外发酵的气体产生量。在培养24 h后，冷水提取物（CAE）、沸水提取物（BAE）、30%乙醇提取物（TEE）、70%乙醇提取物（SEE）的添加使气体产量分别增加了5.37、21.5%、8.06%、15.05%。

由表1可见，与对照组相比，添加蒲公英提取物显著增加了总挥发性脂肪酸的浓度。CAE、BAE、TEE组和SEE组挥发性脂肪酸分别增加了21.66%、27.05%、19.87%、35.54%。 蒲公英提取物对乙酸和丙酸的摩尔比例无显著影响。BAE和SEE显著降低了丁酸的摩尔比。蒲公英提取物对乙酸与丙酸之比无显著影响。

图1 蒲公英提取物对体外瘤胃发酵的影响

表1 蒲公英提取物对体外培养24 h瘤胃挥发性脂肪酸产生量的影响

由表2可见，在培养24 h后，通过添加蒲公英提取物降低了pH。SEE组pH最低。蒲公英提取物对氨态氮浓度无显著影响。与对照组相比，添加沸水提取物和70%乙醇提取物显著减少了原虫的数量，而70%乙醇提取物组的原虫数量比沸水提取物组的原虫数量更低。

表2 蒲公英提取物对体外培养24 h瘤胃pH、氨态氮浓度以及原虫数量的影响

3 讨论

Menk 等（1979）研究表明，200 mg 饲料干物质的24 h体外发酵产生的气体量与羊体内有机物质消化率高度相关。本研究中，蒲公英提取物的添加增加了24 h的气体产生量，这表明蒲公英提取物可提高瘤胃有机物的消化率。本研究未测定气体中二氧化碳、甲烷和氢气浓度，进一步的研究工作需要评价蒲公英提取物对瘤胃产气中各成分的含量的影响，例如甲烷和氢气。

挥发性脂肪酸被视为瘤胃发酵指数之一，其代表瘤胃发酵模式和营养消化的效率。本研究结果显示蒲公英提取物的添加增加了挥发性脂肪酸浓度，这表明蒲公英提取物能够提高瘤胃内的营养物质消化率。70%乙醇提取物组的挥发性脂肪酸浓度最高，由此推断其对瘤胃营养物质消化影响最大。除了沸水提取物和70%乙醇提取物组丁酸浓度减少外。挥发性脂肪酸和乙酸与丙酸比不受蒲公英提取物的影响，这表明蒲公英提取物对瘤胃发酵模式的影响作用很小。

添加蒲公英提取物可以降低体外培养液的pH。这种因蒲公英提取物的添加降低pH的原因可能是由于挥发性脂肪酸浓度的增加造成的。70%乙醇提取物组的pH最小，这与其最高的挥发性脂肪酸浓度一致。70%乙醇提取物的pH超过正常范围，原因可能是体外发酵产生的大量挥发性脂肪酸不能像体内试验那样被瘤胃吸收。蒲公英的茎、根和花含有高浓度的皂苷 （Mir等，2013）。因为原虫细胞膜的甾醇可与皂苷结合，所以原虫对皂苷敏感。本研究中，添加沸水提取物、70%乙醇提取物分别使原虫的数量减少30.43%和54.66%，并且70%乙醇提取物组的原虫数量低于沸水提取物。这表明沸水提取物和70%乙醇提取物含有更多皂苷，特别是70%乙醇提取物。研究表明，几种瘤胃原虫可以产生丁酸。本研究中，蒲公英提取物可以减少原虫的数量，这可能是添加蒲公英提取物减少丁酸的原因。

4 结论

添加蒲公英冻干提取物能够影响体外的瘤胃发酵和抑制瘤胃原虫的生长，尤其是70%乙醇提取物效果最明显，这表明蒲公英提取物可能有利于改善反刍动物的营养利用和生长性能。

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