激素协同作用对奶牛乳腺上皮细胞激素受体基因表达的影响

田 青 ， 王洪荣

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003；2.扬州大学，江苏扬州 225009）

激素受体是激素发挥其功能的主要途径。Lee等（2011）发现胰岛素（INS）要发挥其功能，必须先与α亚单位结合后，β亚单位中酪氨酸激酶才被激活，进而使受体磷酸化，介导和调节细胞内酶系统活性，控制物质代谢。李真和李庆章（2010）发现在奶牛乳腺组织中，胰岛素及其受体的变化是有规律的，INS浓度从妊娠期开始上升至分娩前达到最大，而后开始下降；胰岛素受体（INSR）的表达量从青春期到泌乳初期逐渐升高，到泌乳高峰期持续高水平，随后开始下降；催乳素也必须先与特定组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、乳腺、卵巢等）催乳素（RPLR）基因结合才能进入细胞内发挥其功能（王亮，2013）。研究表明，在奶牛乳腺内，催乳素首先与其受体结合，然后激活JAK2激酶，并通过JAK-STAT信号通路刺激乳腺腺泡发育，并在乳腺组织中刺激乳腺酪蛋白基因的表达进而促进乳的生成与分泌、发动和维持泌乳（Akers，2006）。在体内，糖皮质激素与其胞内核受体结合后才能启动并调控相关基因的表达和乳蛋白的合成，并且通过基因组机制实现其生理药理功能（李敏，2010）。

大量研究表明，激素与激素之间或激素与生长因子之间均存在一定的协同作用，如催乳素（PRL）能增加胰岛素促进乳汁分泌和改善乳品质的作用效果，同时添加蛋白质前体物氨基酸尤其是必需氨基酸能显著提高泌乳奶牛的产奶性能等。也有研究表明，INS、PRL和氢化可的松(HYD)对奶牛乳腺上皮细胞生长、相关基因表达及酪蛋白相对含量的影响均存在着最佳使用剂量，即PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL 和 HYD 1 ng/mL，且三者协同作用能促进奶牛乳腺上皮细胞增殖，抑制其凋亡，从而为乳腺的泌乳奠定良好的生理基础（田青和王洪荣，2014、2013）。由此可以推测，三种激素的协同作用对其受体有一定的影响作用。因此，本试验以本试验室前期冻存的奶牛乳腺上皮细胞为对象，采用L9（34）正交试验设计，研究了INS、PRL和HYD的协同作用对奶牛乳腺上皮细胞激素受体基因表达的影响，旨在得到有利于促进奶牛乳腺上皮细胞三种激素受体基因表达的最佳浓度组合，为后期的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 细胞：扬州大学草食动物营养实验室冻存的4代奶牛乳腺上皮细胞。

主要试剂：DMEM/F12 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Gibco）、催乳素（Sigma）、胰岛素-转铁蛋白-硒（Gibco）、表皮生长因子（Sigma）、氢化可的松（Sigma）、胰岛素（Sigma）、胰蛋白酶（Gibco）、DMSO（Gibco）、两性霉素 B（Amresco）、PBS（北京索莱宝）、荧光定量检测试剂盒（TaKaRa，宝生物）。

仪器与设备：电热恒温CO2培养箱 （美国Thermo）、倒置显微镜（CKX41，Olympus）、冷冻离心机 （5415R 型， 德国 Eppendorf）、PCR 仪（ABI 2720型）、NanoDrop ND-1000浓度测定仪 （美国Thermo）、 荧光定量 PCR 仪 （ABI 7500 型）、i-MarkTM 酶标仪（168-1130，美国 Bio-Rad）、移液器（德国 Eppendorf）。

1.2 试验设计 细胞复苏后等密度接种于6孔板，待细胞长满70%～80%时，先用无血清、无激素但含双抗、两性霉素的DMEM/F12培养基过渡16 h以上，后采用L9（34）正交试验设计，即分别用含有不同浓度激素组合的生长培养基于37℃、5%CO2培养箱培养24 h，每个处理设3个重复，每个试验独立重复3次，具体方案见表1。

1.3 RNA的提取、cDNA的合成与real-time PCR 总RNA的提取：生长培养基培养24 h后收获细胞， 用 RNAiso Plus （TaKaRa，D9108A）总RNA提取试剂盒提取RNA，所有RNA样品用紫外分光光度计 （NANODROP-1000）测定其 260/280 nm吸收比率值，用以检测RNA浓度、纯度和完整性。提取的RNA保存于-70℃，待用。

表1 正交试验因素与水平 ng/mL

反转录：以提取的RNA为模板，用Prime-Script® RT Master Mix（TaKaRa，DRR036A）反转录试剂盒制备cDNA，其总反应体系为80 μL。转录得到的RT-PCR反应液于4℃保存。

real-time PCR：反转录得到的RT反应液用SYBR® Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，DRR081A）试剂盒进行real-time PCR，采用20 μL体系。反应条件为 95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 个循环；溶解曲线 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

各基因的相对表达量用2-ΔΔCT值表示。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞中激素受体相关基因表达的检测 以GAPDH为内参，采用Primer3软件进行引物设计，引物信息见表2。

1.5 数据统计与分析 所有原始数据先用Excel进行数据统计，用SAS 9.1中ANOVA进行显著性分析，Tukey法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

表3结果显示，各试验组三种激素受体基因表达量与对照组相比差异均不显著（P>0.05），各试验组之间三种激素受体基因表达量差异也不显著（P>0.05），但各试验组三种激素受体基因表达量均高于对照。

表2 引物信息

表3 激素协同作用对奶牛乳腺上皮细胞激素受体基因表达的影响

从三种激素协同作用对奶牛乳腺上皮细胞影响的最优组合和影响程度来看，对s-PRLR基因，三种激素的最优组合为A1B2C2（PRL 5 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 1 ng/mL），三种激素对试验结果的影响程度为C＞B＞A；对NR3C1基因，三种激素的最优组合为 A2B1C3（PRL 50 ng/mL、INS 5 ng/mL、HYD 10 ng/mL），三种激素对试验结果的影响程度为A＞B＞C；对INSR基因而言，三种激素的最优组合为 A2B2C1（PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 0.1 ng/mL），三种激素对试验结果的影响程度为A＞C＞B。

3 讨论

通过对试验结果的分析可以看出，受体基因不同，三种激素的最优组合和影响程度也各不相同，试验结果并未表现出明显的规律，也没有对三种激素受体均一致的最优组合。但可发现，三种激素的组合中某种激素含量高，对应的该种激素受体的表达量就高 （氢化可的松除外，NR3C1的表达量随着氢化可的松的增加而降低），由此可知，对于泌乳期的奶牛，催乳素的需要量适当大一些，胰岛素次之，氢化可的松的用量最小。

研究认为胰岛素通过与受体结合，主要通过mTOR信号通路发挥作用，即胰岛素激活IRS-1，IRS-1的磷酸化可活化信号分子PI3K，活化后的PI3K催化其下游靶蛋白Akt磷酸化，磷酸化的Akt抑制TSC2的活性，在TSC1的参与下，mTOR被激活，进而发挥调节糖代谢的功能 （Biona和Loor，2011；Sophie 等，2007）；对于催乳素，比较公认的则是催乳素与受体结合后激活JAK2/STAT5信号通路，也可激活Ras/Raf/MAPK及ERK和PI3K/AKT信号通路，进而促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖，维持泌乳和促进乳蛋白的合成（Swaminathan 等，2008；Wagner等，2004；）；关于氢化可的松参与奶牛乳蛋白合成调控的研究并不多见，但有研究表明糖皮质激素通过调控E6-P53-miR145信号通路诱导宫颈癌细胞产生耐药表型 （杜利彬，2011），也有研究表明氢化可的松发挥作用主要是在机体处于能量负平衡等特殊状态下促进乳腺周围营养物质的重分配而维持产奶量和乳蛋白含量的，由此可以推测，动物处于不同生理条件下，氢化可的松的作用信号通路不同，糖皮质激素发挥的作用也不同。在奶牛的乳腺中，前期研究发现单独添加氢化可的松的确具有增加奶牛乳腺上皮细胞合成乳蛋白能力的作用（田青和王洪荣，2014）。

从功能上来看，催乳素的主要功能是启动和维持泌乳，胰岛素则主要与能量代谢有关，而氢化可的松主要与炎症反应（免疫）有关。催乳素可以通过与其受体结合先为泌乳的启动和维持奠定生理基础（充分发育的乳腺），胰岛素可以通过与其受体结合为乳腺上皮细胞的生长、泌乳的启动和维持提供能量保证（充分的能量），而氢化可的松则可以通过与其受体结合而维持乳腺细胞组织健康。在体外培养的条件下，奶牛乳腺上皮细胞要增殖和生长就需要较多的催乳素和胰岛素参与，所以催乳素和胰岛素受体的表达量也相对较高；而体外培养主要是在无菌条件下培养得到的具有正常形态和生物学功能的健康乳腺上皮细胞，所以不需要更多的氢化可的松发挥其抗炎症功能，因此对应的氢化可的松受体基因表达量就较低。

4 结论

4.1 催乳素、胰岛素和氢化可的松协同作用有利于促进PRLR、NR3C1、INSR基因受体的表达。

4.2 催乳素、胰岛素和氢化可的松协同促进s-PRLR、NR3C1和INSR基因表达的最优组合分别为催乳素5 ng/mL、胰岛素50 ng/mL、氢化可的松1 ng/mL，催乳素50 ng/mL、胰岛素5 ng/mL、氢化可的松10 ng/mL和催乳素50 ng/mL、胰岛素50 ng/mL、氢化可的松0.1 ng/mL；对s-PRLR、NR3C1和INSR基因表达影响的大小次序分别为：氢化可的松>胰岛素>催乳素；催乳素>胰岛素>氢化可的松；催乳素>氢化可的松>胰岛素。

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