利用微卫星标记分析兴义鸭的遗传多样性

李志惠，李杰章，张依裕*

（1.贵州农业职业学院畜牧水产系，贵州清镇 551400；2.贵州大学 动物科学学院，贵州贵阳 550025）

地方鸭种的研发一直是畜牧业的重要组成部分。目前，越来越多的畜禽品种资源出现不同程度的减少，究其原因还是我们对这些畜禽品种认识不够深入，如兴义鸭、纳雍糯谷猪、长顺绿壳蛋鸡等（林家栋等，2008；焦仁刚，2008），加强对相关畜禽品种资源的研究是推动畜牧业可持续发展的有效途径，也是加快从传统地方畜禽养殖转变为新型地方畜禽养殖的捷径，为实现富农强农提供更多的参考。

微卫星由少数核苷酸（通常是以1～6个碱基为重复单位）组成的串联重复序列，因其重复程度和次数的不同造就了微卫星具有高度多态性、在基因组中可以大量存在、均匀分布和变异强度大等优点，成为一种常用的分子标记方法，运用该方法可以迅速从基因组中选取微卫星序列并顺序化，能高效率的使用PCR方法扩增和进行凝胶电泳的分析（盛岩等，2002）。段修军等（2008）、马洪雨等（2006）利用微卫星标记法在不同的畜禽领域取得了研究成果，本次试验分析方法参照上述前辈的方法，运用微卫星标记分析兴义鸭的遗传多样性，旨在加速兴义鸭开发利用的进程，丰富地方鸭种的基因库，更好地保护地方畜禽资源，既保障畜牧业的健康发展和相关产品的研发，同时也为地方畜禽的育种工作带来一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 研究所采集的兴义鸭样本是经贵州大学动物科学学院出资，由贵州省金沙县禹谟镇的专业养殖户提供养殖场地，在养殖过程中半封闭饲养，公母隔离，饲养过程中保持营养水平相同、饲养管理基本一致，将雏鸭（120只）喂养至10周龄，随机选择健康、体质好的兴义鸭60只（♀：47只；♂：13只）翅膀静脉采集血样，-20℃保存备用。

1.2 微卫星引物 本研究采用20对引物的微卫星引物序列进行合成，合成公司为上海生物有限股份公司，各引物序列及退火温度和片段范围见表1。

1.3 基因组DNA提取 取常用的酚/氯仿抽提法来提取样品中DNA，制备1%琼脂糖凝胶，对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电压120 V、20 min，在完成琼脂糖凝胶电泳检测后，运用紫外分光光度计测量DNA浓度已经足够高，可用于完成后继实验，放置于-20℃的冰箱保存备用。

 表1 微卫星引物的序列及退火温度

1.4 PCR反应与PCR产物检测 聚合酶链式反应（PCR）体系：加入0.8 μl的DNA模板，上游引物和下游引物均各加1.1 μl，灭菌双蒸水加6 μl，Ultra S8YBR Mixture（mixRox）加 11 μl，最终总体积为20 μl。建立PCR反应程序，预变性温度是 95℃、5 min，变性温度是 95℃、30 s，退火温度是 60℃、50 s，72℃延伸 30 s，共 40个循环；72℃延伸10 min；10℃保存。PCR反应产物在进行PAGE凝胶电泳，电泳仪电压设置为120 V、16 min，电泳完成后放置在凝胶成像仪上，观察并截图保存。

1.5 数据分析 根据条带位置确定基因型，其中微卫星座位的有效等位基因数（Ne）由公式：计算。微卫星座位的等位基因频率（P）由公式 ：Pi=[2（ii）+（ij1）+（ij2）+ …+（ijn）]/2N计算。微卫星座位的多态信息含（PIC）由公式。微卫星座位的基因杂合度（H）由公式

2 结果与分析

2.1 基因组DNA质量检测 提取兴义鸭血样DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果见图1。由图1可见，DNA完整性较好，NANODROP 2000 DNA浓度测定仪检测结果显示，OD260/OD280为 1.8～2.0。

图1 鸭血基因组DNA检测

2.2 微卫星座位的多样性检测 通过12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星座位的多态性，图谱见图2。由表2可知，20对微卫星引物均能扩增出特异性条带，显示出20对微卫星引物的均显现出多态，部分引物扩增条带呈现高度变异性，均可用于群体遗传多样性的评估。

图2 AJ272580 和 AJ272579 引物 PCR 产物的电泳图谱

2.3 微卫星基因座等位基因数及等位基因频率根据各微卫星引物的扩增条带和扩增片段大小范围，统计其每个微卫星基因座等位基因数及等位基因频率，结果显示，在20对微卫星引物中共检测到85个等位基因，平均每个微卫星基因座等位基因数4.2500个，AJ272580座位等位基因有7个，AJ272579和AJ272581座位等位基因各6个，AJ272582、AJ515884、AJ515887、AJ515890、AJ515893等位基因数均为5个，AJ272577、AJ272583、AJ515891、AJ515896、AJ515898、AJ515899等位基因数均为4个，AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515900等位基因数均为3个，AJ515897座位等位基因最少，为2个。

2.4 微卫星基因座群体杂合度、多态信息含量和有效等位基因数 结果见表2，20个微卫星基因座群体杂合度中，位点AJ272580的群体杂合度最高，为0.8304，位点AJ515883的群体杂合度最低，为0.4919，其他的群体杂合度大多是在0.59～0.79之间，各位点平均群体杂合度为0.6850。多态信息含量最高的是位点AJ272580的0.8085，多态信息含量最低的是位点AJ515897的0.3733，其他的大多为0.50～0.77，各位点平均多态信息含量为0.6284。有效等位基因数最高的是位点AJ272580的5.8955，最低的是位点AJ515883的1.9681，其他大多为2.5～4.9，各位点有效等位基因数的平均值是3.4449。

3 讨论

群体杂合度可以用于测定每个种群的遗传变异，由表2可见，兴义鸭的群体平均杂合度0.6850大于0.5，表明兴义鸭的群体遗传多样性水平较大，可用于进一步选择。常洪（2003）指出，在探讨遗传多样性抽样时，样本的雌雄比是4∶1，且样本数应达到60羽，符合前人要求，在凝胶判定基因型时条带应清晰，上述要求本试验基本达到。

表2 微卫星基因座群体杂合度、多态信息含量 和有效等位基因数

多态信息含量是评估物种遗传多样性的一个良好的指标，根据Botstein等研究结果，兴义鸭AJ515883位点和AJ515897位点的PIC为0.25～0.5，表现为中度多态位点，剩下的18个微卫星位点的PIC均大于0.5，呈现出高度多态，兴义鸭的平均PIC为0.6284均大于0.5，这20个位点均能用于反映出兴义鸭的高度遗传多样性。要想较好的用做遗传多样性的评估，每一个微卫星位点的等位基因都应拥有4个以上，由微卫星基因座等位基因数及等位基因频率结果可以看出，20个微卫星位点里只有AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515897、AJ515900这 6个微卫星位点的等位基因都小于4，没有呈现高度的多态，只表现出中度或低度多态。有效等位基因数也是标榜一个群体遗传变异的尺子，有效等位基因数和等位基因的绝对数越相近，群体中等位基因的分布越平均，平均有效等位基因数为3.4449，表明20个微卫星基因数较大，其遗传多样性较丰富，人们就能有更好的能力来保持有效等位基因的选择。

结合汤青苹等（2006）的研究，影响最终试验结果的原因包括所采集的样本均由兴义本地提供，由于当地交通不利，农产品也基本自给自足，导致兴义鸭与外界鸭种的基因交流不畅，较好保留了其基因的完整性，所以试验动物具有代表性，这项研究中对兴义鸭的选育保种带来了一份珍贵的参考资料。总而言之，结果表明，本试验所用的20个微卫星位点都能用于鸭类遗传多样性的检查。